Фармакопея.рф

ОФС.1.7.2.0005.15 Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин

ОФС.1.7.2.0005.15 Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения иммуногенности коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандартному образцу. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella рertussis 18323 по методу Kendrick.

Материалы

Животные

Здоровые мыши с массой тела (11±1) г чувствительной линии или аутбредные мыши, способные давать адекватный иммунный ответ. Используют мышей одного пола или самцов и самок, равномерно распределенных по группам. В 1 опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г. Перед проведением испытания за животными проводят наблюдение в течение 3 сут. При гибели более 10 % мышей данную партию не используют.

Референс-препараты

Тест-штамм

B. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно.

Среды

Используют среды Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА), их модификации или другие среды, адаптированные к коклюшному микробу.

Среда Борде-Жангу

В 1500 мл воды очищенной последовательно растворяют ингредиенты:

Полученный солевой раствор до внесения следующих ингредиентов должен иметь рН 7,4–7,5.

Затем в солевой раствор вносят:

Среду кипятят до полного растворения агара, устанавливают рН 7,1–7,2, разливают по (200 ± 5) мл в стерильные флаконы вместимостью 500 мл и стерилизуют при температуре 110 ºС в течение 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 3 мес.

Фильтрат картофельного отвара

В 1 л воды очищенной вносят 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и кипятят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля втечение 1,0–1,5 ч. Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку. Картофельный отвар используют свежеприготовленным.

Для получения  среды Борде-Жангу с 30 % крови содержимое флакона нагревают до температуры 50-55 ºС, вносят 60 мл дефибринированной крови человека, перемешивают и разливают в чашки Петри. Срок хранения среды с кровью — 10 сут при температуре от 2 до 8 ºС.

Примечание.

Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие возбудителей инфекций, которые передаются при гемотрансфузиях, в соответствии с утвержденными уполномоченными органами РФ «Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови» и «Инструкцией по проведению донорского прерывистого плазмафереза». Срок хранения крови не более 2 сут.

Среда КУА (казеиново-угольный агар)

На 1 л среды добавляют:

Содержание хлоридов в среде должно составлять (0,75 ± 0,15) %, аминного азота (155 ± 10 мг %); рН среды доводят до 7,0-7,1 с помощью 20 % раствора натрия гидроксида.

Среду разливают в матрацы по (250 ± 10) мл, пробирки по (11 ± 1) мл и флаконы вместимостью 500 мл по (200 ± 5) мл, стерилизуют 30 мин при температуре 110 ºС и хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 мес. Для получения среды с 10 % крови содержимое флакона растапливают,  охлаждают до температуры 50–55 ºС, вносят 20 мл дефибринированной крови человека и перемешивают. Срок хранения среды с кровью 10 сут при температуре от 2 до 8 ºС.

Гидролизат казеина:

Степень расщепления белка – не менее 93 %. Аминный азот  850-1000 мг %, общий азот 910-1080 мг %, натрия хлорид 4-6 %. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 110 ºС. Среду используют свежеприготовленной (при добавлении 0,5 % хлороформа срок хранения 1 год при температуре от 2 до 8 ºС).

Дрожжевой диализат:

Аминный азот – не менее 0,54 мг/мл. Срок хранения 3 мес при температуре от 2 до 8 ºС.

1 % раствор гидролизата казеина

Гидролизат казеина – 10 мл (аминный азот 8,5–10,0 мг/мл), натрий хлористый – 6,0 г (до концентрации хлоридов 0,6 %), вода очищенная – до 1000 мл. С помощью 20 % раствора натрия гидроксида рН доводят до (7,1±0,2). Среду стерилизуют 15 мин при температуре 121 ºС. Срок хранения 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 сут.

Метод исследования иммуногенной активности коклюшной вакцины

Мышей распределяют в группы по 18-20 животных в каждой: по 2 группы для испытуемого и референс-препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма B. pertussis 18323 (определение LD50 культуры)  из этой же партии животных формируют 4 группы по 10 мышей в каждой.

Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках, и порядок введения разрешающей дозы.

Иммунизация мышей

Готовят по 3 пятикратных разведения испытуемого и референс-препаратов. В качестве растворителя используют 0,9 % раствор натрия хлорида, рН (7,1 ± 0,2). В интервале используемых разведений каждого образца должна содержаться средняя эффективная доза ЕD50.

В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 МЕ (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).

Таблица 1– Пример разведения референс-препарата

Разведение Объем вносимого разведения I референс-препарата, мл Объем вносимого растворителя, мл Разведения референс-препарата (в 0,5 мл) Иммунизирующая доза– 0,5 мл
Количество исходного референс-препарата, мл Количество МЕ
I 15 0 1:60 0,0167 0,5
II 2,5 10,0 1:300 0,0033 0,1
III 0,5 12,0 1:1500 0,00066 0,02

Образец испытуемой вакцины разводят в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если полученное в опыте значение ЕD50 испытуемой вакцины будет больше значений использованных доз, необходимо изменить разведение I (например, 1:10). Последующие 2 разведения делают по вышеприведенной схеме.

Приготовленные разведения вакцины и референс-препарата хранят при температуре от 2 до 8 ºС и используют в течение не более 4 ч.

Таблица 2 – Пример разведения испытуемой вакцины

Разведение Объем вно-симого I разведения вакцины, мл Объем вносимого растворителя, мл Кратность разведений исходной вакцины

(в 0,5 мл)

Иммунизирующая доза в объеме 0,5 мл
Количество исходной вакцины, мл Количество МЕ (предполагаемое содержание)
I 14 0 1:28 0,0357 0,5
II 2,5 10,0 1:140 0,0071 0,1
III 0,5 12,0 1:700 0,00142 0,02

Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл одного из разведений испытуемой вакцины или референс-препарата. К моменту введения заражающей дозы не менее 94 % иммунизированных мышей должно остаться в живых и без признаков заболевания. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.

Приготовление заражающей суспензии тест-штамма B. рertussis 18323

Бактериальную суспензию B. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20-24-часовой культуры второго–третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу, с кровью человека или КУА с кровью человека или на других, адаптированных к коклюшному микробу средах.

Выросшую культуру контролируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Микробные клетки B. рertussis 18323 должны быть морфологически однородны. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать.

Готовят бактериальную суспензию микробных клеток с концентрацией, соответствующей 10 МЕ по стандартному образцу мутности (разведение 1А). Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% раствор натрия хлорида, рН (7,1±0,2).

Полученную суспензию разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл (100–1000 LD50) . Из рабочей суспензии готовят разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения LD50  тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл. 3).

Таблица 3 – Пример разведения тест-штамма B. рertussis 18323

Номер пробирки Кратность разведения Объем перено-

симой суспен-зии из предыдущей пробирки в последующую, мл

Объем внесенного растворителя,мл Полученная суспензия

содержит в 0,03 мл (эквивалентно)

Назначение
1 1А : 3 1 2 100 млн
2 1I : 10 0,5 4,5 10 млн
3 12 : 10 0,5 4,5 1 млн
4 13 : 10 2 18 100000 Разливают в 3 пробирки для заражения –

рабочая суспензия

5 14 : 10 0,5 4,5 10000 Для определения LD50 штамма
6 15 : 5 1,0 4,0 2000
7 16 : 5 1,0 4,0 400
8 17 : 5 1,0 4,0 80

Из пробирки 8 сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью с целью подсчета количества содержащихся в ней живых клеток, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Культуру помещают в термостат с температурой (36 ± 0,5) оС на 3-4 сут. Для определения количества КОЕ в 30 мкл проводят подсчёт выросших колоний на 3 чашках и полученное значение делят на 10. В 0,03 мл разведения из пробирки 8 должно быть не более 50 КОЕ.

При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента приготовления смыва культуры.

Если в испытании используют высокочувствительную к коклюшным антигенам линию мышей, то заражающую дозу тест-штамма 18323 следует уменьшить до содержания 100–1000 LD50  в объеме 0,03 мл.

Заражение иммунизированных животных

Мышам, иммунизированным испытуемой вакциной и референс-препаратом, через 14-17 сут интрацеребрально вводят по 0,03 мл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма B. рertussis 18323 (пробирка 4) путем прокола лобной кости в точке, расположенной в 2 мм от средней линии и на 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу № 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины LD50 разведения заражающей дозы (пробирки 5, 6, 7, 8) вводят контрольным мышам соответствующих групп интрацеребрально по 0,03 мл.

Мышей, погибших в течение 3 сут после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель); в каждой клетке оставляют по 16 мышей.

За зараженными животными наблюдают 14 сут с ежедневной регистрацией их гибели. В день учета результатов (14-е сут) в число погибших включают также всех парализованных мышей.

Вычисление величины LD50  (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:

lgLD50 = lg DN–δ(∑Li–0,5),

где

DN — максимальная из испытуемых доз;

δ — логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);

Li — отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

∑Li — сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Таблица 4 – Пример расчета величины LD50 культуры тест-штамма B. рertussis 18323

Доза культуры (число микробных клеток)

0,03 мл

Число зараженных животных Число погибших (парализованных) из общего числа зараженных животных Значения Li LD50 Кол-во колоний в заражаю-щей дозе 80 клеток
104 10 9/10 0,9 648 23
2 103 10 7/10 0,7
4 102 10 4/10 0,4
80 10 2/10 0,2

∑Li=2,2

lg LD50 = lg 104–lg 5 (2,2–0,5)=4,0–0,699 1,7=2,8117

LD50=648 микробных клеток.

В заражающей дозе (105 микробных клеток) содержится 648=154 LD50

Оценка иммуногенной активности испытуемой вакцины

Расчет иммуногенной активности испытуемого препарата проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США (для n=16) или статистическим методом с помощью программы Probit-analysis. Для проведения расчета в таблице Вильсона-Вустера (табл. 5) по вертикальной оси отмечают величину, равную сумме выживших мышей от всех 3 доз препарата (А), по горизонтальной оси – разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыт (В). В месте пересечения прямых, проведённых от соответствующих величин А и В, находят ЕD50 (верхняя цифра) и её стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Найденное значение соответствует ЕD50 для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины ЕD50  в опыте, найденную в таблице величину ЕD50 делят на 100 и умножают на значение средней иммунизирующей дозы в данном опыте. Результаты опыта считают достоверными, если стандартное отклонение средней иммунизирующей дозы  не ниже 64 % и не выше 157 % от найденного значения ЕD50.

Примеры расчета количества МЕ в 1 мл по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6.

Таблица 5 –  Таблица Вильсона-Вустера

Таблица 6 – Пример расчета иммуногенной активности вакцины

Препарат Доза препарата в 0,5 мл Количество выживших мышей/общее число зараженных в группе Величины А/В и ЕD50 по таблице ЕD50 (стандарт-ные от-клонения в опыте)
Разведение Количество исходного препарата,мл Количе-ство МЕ в имму-низирующей дозе
Референс-препарат 1:60 0,0167 0,5 14/16 27/11

71,3

72–139

0,0023

(0,00327–

0,00169)

1:300 0,0033 0,1 10/16
1:1500 0,00066 0,02 3/16
Вакцина 1:28 0,0357 13/16 23/11

111,75

72–139

0,0079

(0,011–

-0,0057)

1:140 0,0071 8/16
1:700 0,00142 2/16

Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 МЕ (табл. 6). При определении ЕD50  референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в МЕ.

Количество МЕ в 1 мл вакцины определяют по формуле:

Доверительный интервал значения иммуногенности (МЕ/мл) препарата рассчитывают по формулам:

где

R – количество МЕ в 1 мл препарата;

Rмин – нижний предел доверительного интервала;

Rмакс  – верхний предел доверительного интервала;

К – доверительный коэффициент.

где S1 = (lg ЕD50 )макс.-lg ЕD 50  для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия — 95  или 99%;

S2 = lg ЕD50-(lg ЕD50)мин. для менее иммуногенного препарата.

Для примера:

К=1,6

Отсюда:

Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 МЕ с доверительным интервалом от 5,6 до 14,4 МЕ.

Если в первом опыте активность препарата не соответствует установленным требованиям, опыт повторяют. В этом случае при вычислении количества МЕ в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3). Используют расчет средней геометрической (Xгеом.) величины значения по формуле:

где

Пx — произведение усредняемых величин;

n — число определений.

Критерии достоверности теста:

Скачать в PDF ОФС.1.7.2.0005.15 Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин

Exit mobile version