Глава 1. Выделение и характеристика клеточных субстратов, используемых при производстве биотехнологических (биологических) препаратов

1. Введение, область применения

Ряд проблем, связанных с качеством получаемых из клеток биологических лекарственных препаратов, обусловлены наличием посторонних контаминантов или свойствами клеток, используемых в производстве препарата. Для препаратов, получаемых с применением технологии рекомбинантной ДНК, кроме того, характерны проблемы качества, связанные с экспрессирующей конструкцией клеточного субстрата. Таким образом, свойства клеточного субстрата и процессов, затрагивающих клеточный субстрат, в результате могут влиять на качество лекарственного препарата и безопасность его применения. Кроме того, эффективный контроль качества этих препаратов требует надлежащей проверки всех манипуляций с клеточным субстратом.

Настоящая глава дополняет другие главы настоящих Правил и рекомендации Евразийской экономической комиссии (далее – Комиссия), что позволяет обеспечить всесторонний подход к оценке результатов качества, связанных с биологическими параметрами технологии получения препаратов из культур клеток Metazoa и микроорганизмов.

Действие настоящей главы распространяется на клеточные субстраты, в отношении которых создана система банков клеток. Для целей настоящих Правил под клеточным субстратом понимаются микробные клетки или линии клеток, выделенные из источников человеческого или животного происхождения, обладающие полным потенциалом, необходимым для продуцирования в условиях in vivo или ex vivo биотехнологических (биологических) препаратов для медицинского применения. Реактивы для диагностического применения в условиях in vitro в настоящей главе не рассматриваются. Источники клеточных линий животного происхождения включают в себя все организмы, принадлежащие к подцарству Metazoa. Описаны перевиваемые клеточные линии с неограниченной продолжительностью жизни in vitro, диплоидные клетки с ограниченным сроком жизни in vitro, а также клеточные субстраты микробиологического происхождения (бактерии, грибы, дрожжи и другие одноклеточные организмы).

Настоящая глава включает в себя общие вопросы по стандартам получения клеточных линий человека и животных, микробных клеток, а также вопросы формирования и характеристики банков клеток, используемых для производства биологических препаратов, рекомендации по получению данных, которые необходимо включить в регистрационное досье при подаче заявления на регистрацию биологического препарата в государствах-членах.

Настоящая глава касается биологических препаратов, полученных из клеток, культивируемых из банков клеток, за исключением таких микробных метаболитов, как антибиотики, аминокислоты, углеводы и прочие низкомолекулярные вещества. Банки клеток, используемые для получения препаратов для генной терапии или вакцин, должны соответствовать требованиям, указанным в настоящей главе. Некоторые биологические препараты (например, определенные вирусные вакцины) производят на первичных клеточных культурах, полученных непосредственно из тканей или органов животных. Первичные клетки не используются для создания банка клеток, и поэтому настоящие Правила на них не распространяется. Однако в приложении приводятся другие подходы, которые могут быть применимы к таким первичным клеткам.

Требования к клеточным субстратам

Источник, история и получение клеточного субстрата

2.1.1. Необходимо представить первичную документацию, в которой описывается общая информация о клеточном субстрате, используемом для производства биологического препарата, а также о каждой родительской клеточной линии, из которой клеточный субстрат был выделен полностью или частично. Мероприятия, проводимые на этапе научных исследований и разработок клеточного субстрата, могут оказывать существенное влияние на риски, связанные с использованием в производстве конкретного клеточного субстрата. Представленная в связи с этим информация облегчает всестороннюю оценку рисков, позволяющую гарантировать качество и безопасность применения препарата.

Все производимые с клеточным субстратом манипуляции необходимо подробно документировать на протяжении всего процесса разработки. Описание истории клетки является одним из множества инструментов, используемых при установлении характеристики клеточного субстрата. Как правило, недостаточность данных об истории клеток не может служить препятствием для регистрации лекарственного препарата, но отсутствие достаточного объема данных может в результате привести к повышенной зависимости от других методов, используемых для характеристики клеточного субстрата.

2.1.2. Происхождение, источник и история клеток.

Необходимо указать источник клеток (лабораторная коллекция или коллекция культур), из которого был получен клеточный субстрат, и привести соответствующие ссылки на научный литературный источник. Предпочтительны данные, полученные непосредственно из исходной лаборатории. Если эта информация недоступна, можно использовать литературные данные.

Для клеточных линий человека необходимо описать следующие характеристики первоначального донора: происхождение ткани или органа, этническое и географическое происхождение, возраст, пол и общее физиологическое состояние. При наличии следует привести данные о состоянии здоровья или анамнез донора наряду с результатами любого тестирования донора на наличие патогенных агентов. Поскольку для диплоидных фибробластов человека возраст донора может влиять на продолжительность жизни клеточной линии in vitro, эти данные (при их наличии) следует представлять. При использовании линии животных клеток в описании источника необходимо указать виды, породы, условия разведения, происхождение ткани или органа, географическое происхождение, возраст, пол, а также результаты тестирования на наличие патогенных агентов и общее физиологическое состояние первичного донора.

При использовании микроорганизмов производители должны указать их вид, штамм и известные генотипические и фенотипические характеристики организма, из которого был выделен клеточный субстрат. Производители также должны привести данные по патогенности, токсигенности и прочую информацию о биологической опасности (если она имеет место).

Должна быть документально оформлена история культивирования клеток. Наряду с процедурами культивирования клеток in vitro и всеми процедурами создания клеточных линий (например, использование физических, химических, биологических методов или введение нуклеотидных последовательностей) необходимо описать метод, первоначально использованный для выделения клеток. Необходимо описать все имевшие место генетические манипуляции или генетический отбор (селекцию). Вся доступная информация, относящаяся к идентификации, характеристикам этих клеток и результатам их испытания на наличие эндогенных или посторонних агентов, тоже должна быть предоставлена.

Для перевиваемых клеточных линий, полученных от Metazoa, обычно бывает достаточно определить продолжительность культивирования путем оценки либо числа удвоений популяции, либо числа субкультивирований при определенном коэффициенте разведения или времени культивирования (в днях). Для линий диплоидных клеток, обладающих ограниченным сроком жизни in vitro, важна точная оценка числа удвоений на протяжении всех стадий исследования, разработки и производства. Для клеток микроорганизмов считается достаточным представление документации, содержащей сведения по определению частоты субкультивирования после создания клеточного субстрата.

В отношении получения клеточного субстрата заявители должны провести тщательный анализ процессов, при использовании которых возможен занос инфекционных агентов. Должно быть представлено описание компонентов культуральной среды, особенно информация, касающаяся воздействия на клетки таких компонентов человеческого и животного происхождения, как сыворотка, ферменты, гидролизаты или другие живые клетки. Описание должно включать источник, метод приготовления и контроля, результаты испытаний и обеспечение качества. Могут быть приведены соответствующие ссылки на литературные источники, если таковые доступны. Эта информация позволит провести детальный анализ возможных путей проникновения посторонних агентов из указанных источников и станет составной частью анализа соотношения «польза – риск» для препарата.

2.1.3. Создание клеточного субстрата (получение клеток- продуцентов).

Ключевой стадией является выбор подходящей родительской клеточной линии. Для рекомбинантных препаратов родительской клеточной линией служит, как правило, клеточная линия – реципиент, не подвергшаяся трансфекции. В этой ситуации рекомендуется использование охарактеризованных банков родительских (исходных) клеток. Охарактеризованный банк родительских (исходных) клеток может представить данные, на основании которых может быть проведена оценка качества ГБК, особенно в случаях, когда множество клеточных субстратов образовано из одного и того же типа родительских клеток. Например, клеточная линия миеломы может быть заготовлена в качестве родительской (исходной) клеточной линии для гибридомы.

При окончательной разработке требуемых характеристик в процессе создания клеточного субстрата возможно использование одной или нескольких специфических процедур. К ним относятся, например, слияние (гибридизация) клеток, трансфекция, отбор клонов, выделение колоний, клонирование, амплификация генов и адаптация к специфическим условиям культивирования или средам. Информация, касающаяся методологии, используемой при разработке клеточного субстрата, может помочь в обеспечении понимания истории клеточного субстрата. Некоторые клеточные субстраты, например, диплоидные фибробласты человека, могут не требовать интенсивной обработки или предварительного клонирования перед созданием банка клеток.

В рекомбинантных препаратах клеточным субстратом служат трансфецированные клетки, содержащие           требуемые последовательности, которые были клонированы из единственной клетки предшественника. При создании клеточных субстратов с использованием технологии рекомбинантной ДНК необходимо учитывать рекомендации главы 5.2 настоящих Правил. Для нерекомбинантных препаратов (в том числе нерекомбинантных вакцин) клеточным субстратом служат клетки из линии родительских (исходных) клеток, отобранных для создания ГБК, без дальнейшей модификации. Для препаратов, получаемых из гибридом, клеточным субстратом служит гибридомная клеточная линия, полученная путем слияния родительской клеточной линии миеломы с другими родительскими клетками, например, с иммунными клетками селезенки.

Создание банка клеток

Одним из наиболее важных преимуществ использования серийно субкультивируемых клеток для производства биотехнологических (биологических) препаратов является возможность иметь охарактеризованный общий источник для каждой производственной серии, то есть иметь законсервированный банк клеток. Производители могут создавать свои собственные банки клеток или получать их из внешних источников. Производители обязаны обеспечивать качество каждого банка клеток и проводить с каждым из них необходимые испытания.

2.2.1. Система банков клеток.

Концепция двухуровневой структуры банка клеток, в которой ГБК используется для РБК, как правило, принимается в качестве наиболее практичного подхода, обеспечивающего            получение клеточного

субстрата для непрерывного производства препарата. Производители должны описать стратегию обеспечения непрерывного получения клеток из банка (банков), включая ожидаемую скорость расходования банка клеток при производстве, ожидаемые интервалы между созданием новых банков клеток и показатели, по которым аттестуются (характеризуются) банки клеток.

Как правило, сначала создается ГБК, обычно непосредственно из исходного клона или из предварительного банка клеток, полученного из исходного клона. Приготовление банка клеток из клонов не является обязательным для определенных типов клеток (например, диплоидных клеток, продолжительность жизни которых in vitro ограничена), или при наличии других технических факторов, делающих клонирование клеток

непрактичным, или в случаях, когда неклонированная клеточная популяция уже достаточно гомогенна для предполагаемого применения.

Для создания РБК используются один или более контейнеров с клетками из ГБК. Именно РБК, как правило, используется непосредственно для нужд производственного процесса. По мере необходимости из ГБК создаются дополнительные РБК. Свежеприготовленный РБК должен быть соответствующим образом квалифицирован путем установления его характеристик и проведения испытаний.

ГБК и РБК могут отличаться друг от друга по ряду параметров, например, компонентами культуральной среды и условиями культивирования. Кроме того, условия культивирования, используемые при приготовлении ГБК и РБК, могут отличаться от используемых в процессе производства. Если изменения процесса культивирования клеток не оказывают неблагоприятного воздействия на качество препарата, повторное клонирование клеток или повторное создание ГБК или РБК не требуется. Необходимо убедиться, что охарактеризованный банк обеспечивает получение продукта постоянного качества.

Допускается использование одноуровневого банка, состоящего только из ГБК и не содержащего РБК, например в случае, если для производства препарата каждый год требуется относительно небольшое число контейнеров с клетками.

В некоторых микробных экспрессирующих системах для каждой новой серии контейнеров с клеточным субстратом проводится новая трансформация с использованием аликвот тщательно испытанных банков клеток хозяина и банков плазмид для каждой новой трансформации. Кроме того, проводится испытание каждого банка трансформированного клеточного субстрата. Такой банк трансформированного клеточного субстрата рассматривается как ГБК и используется в качестве источника клеточного субстрата для производственного процесса. Банки клетки хозяина, банки плазмид и ГБК хранятся с помощью соответствующих методов консервации. Эта альтернативная система считается достаточной, поскольку трансформация бактерий и дрожжей, как правило, представляет собой легко воспроизводимый процесс, в отличие от процедуры, применяемой для трансфекции клеток Metazoa. Производители должны предоставлять информацию о клетках хозяина, молекулах рекомбинантной ДНК (таких как плазмиды), методе трансформации и создании банка клеток, а также о результатах исследований по характеристике их свойств.

2.2.2. Процедуры создания и поддержания банка клеток.

Необходимо предотвратить использование контаминированного клеточного субстрата (или банка клеток) в процессе производства препарата и избежать снижения доступности или производства препарата, либо потерь времени при разработке, возникающих в результате необходимости повторного создания банка клеток, который оказался непригодным вследствие контаминации. Ни один режим испытаний банка клеток не позволяет выявлять все возможные контаминанты, поэтому использование описанных предупредительных мер во время создания банка клеток важно для обеспечения достаточной уверенности в отсутствии контаминации, а также для создания надежного источника клеточного субстрата.

Производители должны описать тип используемой системы создания банка, размер банка клеток, тип контейнера (флаконы, ампулы или другие подходящие емкости) и используемую систему укупорки, методы приготовления банка клеток, включая используемые криопротекторы и среду, а также условия криоконсервации и хранения.

Производители должны описать процедуры, используемые для предотвращения микробной контаминации и перекрестной контаминации другими типами клеток, присутствующими в лаборатории, а также описать процедуры, позволяющие отслеживать емкости банка клеток. К этим мероприятиям относится описание системы документации, а также системы маркировки, которая может выдержать процесс консервации, хранения и восстановления без потери информации, нанесенной на контейнер.

Производители должны описать технологию создания и поддержания банка клеток. Как правило, клетки готовятся для банка путем наращивания объемов культивирования за счет постепенного увеличения числа сосудов или использования сосудов большего размера до тех пор, пока не получится пул клеток, которого будет достаточно для создания необходимого числа контейнеров с клетками для банка клеток. Для того чтобы обеспечить однородный состав содержимого каждого контейнера, каждый пул клеток для создания банка должен быть приготовлен путем объединения клеток из всех сосудов для культивирования (при использовании более одного сосуда).

Аликвоты клеток, суспендированных в среде для консервации, переносятся из объединенного пула в стерильные контейнеры, которые затем укупориваются и хранятся в необходимых условиях. Например, клетки животных в средах, содержащих криопротектор, замораживаются в укупоренных контейнерах при заданных контролируемых условиях, а затем переносятся на хранение в жидком азоте, или его парах, или при соответствующих сверхнизких температурах. В зависимости от используемого организма допускается применять иные методы консервации и хранения. Однако они должны позволять поддерживать такую степень жизнеспособности клеток после

разведения, которая была бы и постоянной и пригодной для производственных целей.

Для обеспечения постоянного, непрерывного производства лекарственных препаратов производители должны предусмотреть меры по защите от аварийных ситуаций, которые могут привести банк клеток в непригодное для использования состояние. К таким ситуациям относятся: пожары, перебои в электроснабжении и человеческий фактор. Производители должны описать планы предупредительных мероприятий для таких случаев. Например, к подобным мероприятиям можно отнести хранение контейнеров банка клеток в нескольких морозильных камерах, использование резервных источников питания, использование систем автоматизированного заполнения жидким азотом для контейнеров хранения, хранение части ГБК и РБК в удаленных помещениях или регенерация ГБК.

Исходной точкой для оценки возраста клеток in vitro в процессе производства должен служить момент оттаивания одного или более контейнеров с ГБК. В отношении линий диплоидных клеток продолжительность жизни клеток in vitro следует оценивать исходя из скорости удвоения клеточной популяции. Для диплоидных клеток следует определять допустимый уровень удвоения клеточной популяции, то есть уровень, при котором наступает биологическое старение.

2.3. Общие принципы установления характеристик и испытания банков клеток

Установление характеристик и испытание клеточных субстратов из банков клеток представляет собой критическую составляющую контроля биологических и биотехнологических препаратов.

Установление характеристик ГБК позволяет производителю оценить этот источник с точки зрения наличия клеток других клеточных линий, посторонних агентов, эндогенных агентов и молекулярных контаминантов (например, токсинов или антибиотиков из организма хозяина). Задача подобного тестирования состоит в подтверждении подлинности, чистоты и пригодности клеточного субстрата для использования в производстве. В некоторых случаях целесообразно проведение таких дополнительных испытаний, как проверка на туморогенность или кариотипирование. Программа проведения испытаний, выбранная для конкретного клеточного субстрата, может варьироваться в зависимости от биологических свойств клеток (например, потребности в питательных веществах для роста), истории культивирования клеточного субстрата (включая использование биологических реагентов человеческого или животного происхождения) и наличия подходящих аналитических методик. Объем исследований при установлении характеристик клеточного субстрата может влиять на вид или масштаб стандартных испытаний, необходимых на последующих стадиях производства. Для каждого ГБК производители должны однократно проводить испытания клеточного субстрата на подлинность и чистоту, а также испытание стабильности в ходе культивирования клеток для каждого подлежащего регистрации лекарственного препарата. Кроме того, испытания на чистоту и подлинность следует проводить однократно для каждого РБК. Заявители также должны принять во внимание положения главы 2 настоящих Правил. Необходимо провести соответствующие испытания из числа описанных ниже, их описание и полученные результаты необходимо представить в составе регистрационного досье.

При установлении характеристик клеточных линий, содержащих экзогенные экспрессирующие конструкции, созданные с использованием технологии рекомбинантной ДНК, следует руководствоваться также положениями главы 5.2 настоящих Правил. С помощью аналогичных методов целесообразно также провести анализ кодирующих последовательностей в некоторых клеточных линиях, при получении которых рекомбинантная ДНК не использовалась, если генные последовательности охарактеризованы и хорошо изучены. Однако не обязательно проводить исследования последовательностей, кодирующих такие сложные природные продукты, как, например, антигены микробных вакцин, моноклональные антитела из гибридом, семейства родственных генных препаратов.

При установлении характеристики клеточного субстрата и проведении испытаний производителям рекомендуется использовать современные методы и технологические достижения (при их доступности) при условии, что специфичность, чувствительность и прецизионность новых методов, по крайней мере, эквивалентна таковым параметрам существующих методов.

Производители могут проводить установление характеристик РБК вместо ГБК при условии представления соответствующего обоснования.

2.3.1. Испытания на подлинность.

Чтобы удостовериться в подлинности клеток в банке клеток, необходимо провести соответствующие испытания. При проверке подлинности могут быть оценены как фенотипические, так и генотипические характеристики, которые были установлены при разработке препарата. Не обязательно проводить все возможные испытания, однако объем выполненных испытаний должен быть обоснован. Испытания на подлинность обычно проводятся в отношении

ГБК. Кроме того, ограниченный объем испытаний на подлинность, как правило, проводится в отношении каждого РБК.

2.3.1.1. Клетки Metazoa

Морфологический анализ клеток человека или животных, выращиваемых в виде прикрепляющихся культур, может быть полезным инструментом в сочетании с другими тестами. В большинстве случаев для подтверждения происхождения клеточных линий человека или животных достаточно проведения изоферментного анализа, однако возможно проведение других тестов в зависимости от истории клеточной линии. Для верификации вида организма, из которого были получены клетки, могут быть использованы другие методики, включая, например, дифференциальное окрашивание хромосом (бэндинговая цитогенетика) или использование видоспецифичных антисывороток. Альтернативным подходом является демонстрация наличия уникальных маркеров, например, использование бэндинговой цитогенетики для обнаружения уникальной маркерной хромосомы или анализ ДНК для обнаружения геномного полиморфизма (например, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, вариабельность числа тандемных повторов или повторы геномных динуклеотидов). Достаточным испытанием на подлинность считается и установление вида животного, являющегося источником, и наличие изученных уникальных маркеров для клеточной линии. Экспрессия требуемого продукта может служить дополнением к подтверждению подлинности.

2.3.1.2 Клетки микроорганизмов.

Для большинства клеток микроорганизмов анализ роста на селективных средах обычно достаточен для подтверждения подлинности клетки-хозяина на уровне вида для банка клеток хозяина и банка трансформированных клеток. В случае E. coli, когда могут быть использованы разные штаммы, в качестве дополнительных методов испытания на подлинность следует рассматривать такой метод определения биологических характеристик, как фаготипирование. Для банков плазмид оценка подлинности может быть выполнена с помощью анализа экспрессирующей конструкции в соответствии с главой 5.2 настоящих Правил. Экспрессия требуемого продукта также может быть использована для подтверждения подлинности экспрессирующей конструкции.

2.3.2. Испытания на чистоту.

Важнейшим (критичным) аспектом разработки клеточной линии и создания банка клеток является оценка биологической чистоты ГБК и РБК, то есть доказательство того, что они свободны от посторонних микробных и клеточных контаминантов. При планировании и проведении этих испытаний необходимо учитывать влияние селективных агентов и антибиотиков на обнаружение посторонних микробных контаминантов.

2.3.2.1. Клетки Metazoa

Для проведения испытаний по оценке микробиологической чистоты (бионагрузки) (наличие бактерий и грибов) следует использовать индивидуальные контейнеры (1 % от общего числа контейнеров, но не менее 2 контейнеров) для ГБК и РБК. В отношении остальных показателей следует использовать методологию испытаний микробиологических показателей или стерильности, предусмотренную Фармакопей Евразийского экономического союза (далее – Фармакопея Союза) или иных фармакопеях в соответствии с Концепцией гармонизации фармакопей государств – членов Евразийского экономического союза, утвержденной Решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22 сентября 2015 года № 119.

ГБК и РБК должны быть испытаны на содержание микоплазм. Считаются достаточными методики Фармакопеи Союза, включающие в себя посев на агар и мясо-пептонный бульон, а также метод индикаторной клеточной культуры. Как правило, для проведения испытания достаточно клеток из одного контейнера. Для линий клеток немлекопитающих животных могут быть пригодны альтернативные методы контроля и (или) условия проведения испытаний. Для выбора соответствующей методики производители могут проконсультироваться с уполномоченными органами государств-членов.

Для обнаружения возможной контаминации вирусами должна быть разработана стратегия контроля клеточных субстратов на наличие вирусов, которая позволяет обнаруживать широкий спектр вирусов с использованием подходящих скрининг-тестов и соответствующих специфичных испытаний исходя из истории культивирования клеточной линии. Заявители должны применять требования главы 2 настоящих Правил. В отношении классов препаратов, не охваченных главой 2 настоящих Правил, следует руководствоваться рекомендациями ВОЗ по использованию животных клеток.

Чистота клеточных субстратов может быть нарушена в результате контаминации другими клеточными линиями, происходящими от того же или иного вида животных. Выбор необходимых испытаний зависит от существования возможности перекрестной контаминации другими клеточными линиями. В некоторых случаях необходимо поддержание роста разных клеточных линий в одной и той же лаборатории. При проведении процедур по созданию банка клеток, предусматривающих проведение открытых манипуляций, необходимо исключить одновременное проведение открытых манипуляций с другими клеточными линиями. Если в помещении, в котором осуществляется работа с банком клеток, находилась другая клеточная линия в момент, когда происходили открытые манипуляции с банком клеток (например, культивирование клеток, объединение, отбор аликвот выбранной клеточной линии), необходимо провести их испытания на наличие клеток (или продуктов, полученных из них) из второй клеточной линии. Как правило, указанные в подразделе 2.3.1 настоящей главы методы оценки подлинности клеток достаточны для выявления перекрестной контаминации другими клеточными линиями. Дополнительным подтверждением отсутствия перекрестной контаминации может быть получение препарата, соответствующего установленным требованиям.

2.3.2.2. Клетки микроорганизмов

При планировании и проведении специфических испытаний на посторонние микробные и клеточные контаминанты в банках клеток микроорганизмов необходимо учитывать свойства клеток в банках, возможные контаминанты, упоминаемые в научной литературе, источники, методы и материалы, используемые при культивировании клеток, а также другие организмы, находящиеся в лаборатории, в которой создается банк клеток. Например, возможно проведение визуальной оценки характеристик изолированных колоний с использованием разных микробиологических сред, поддерживающих и не поддерживающих рост клеточного субстрата. Тем не менее от производителей не требуется обязательно охарактеризовывать устойчивые мутанты клеточного субстрата, возникающие при таких исследованиях, или другие артефакты таких испытаний. Цель таких испытаний состоит, скорее, в выявлении существующих контаминантов.

2.3.3. Стабильность клеточного субстрата.

Одним из направлений изучения характеристик клеток является установление их пригодности для целевого использования в производстве. Существуют две проблемы, связанные со стабильностью клеточного субстрата: постоянство производства целевого продукта и сохранение производительности при его хранении в определенных условиях.

В целях оценки стабильности в ходе культивирования для производства необходимо провести исследования не менее чем в двух временных точках: первая – на клетках, подвергшихся минимальному количеству субкультивирований, вторая – на клетках при предельном для производства клеточном возрасте in vitro, описанном в регистрационном досье, или при превышении его. Предельный для производства клеточный возраст in vitro следует определять на основании данных, полученных на клетках-продуцентах, выращиваемых в опытно-промышленном или промышленном масштабе до предлагаемого предельного клеточного возраста in vitro или до возраста, превышающего его. Как правило, клетки-продуценты получают из РБК. Клетки из ГБК можно использовать при соответствующем обосновании. Оценка стабильности клеточного субстрата проводится обычно один раз для каждого регистрируемого лекарственного препарата.

Первостепенное значение имеет оценка способности клеточного субстрата обеспечить постоянство производства требуемого продукта. Вид проводимых испытаний и объекты исследований зависят от типа клеточного субстрата, продукта и методов культивирования. Для клеточных линий, содержащих экспрессирующие конструкции на основе рекомбинантной ДНК, неизменность кодирующей области экспрессирующей конструкции должна быть подтверждена на предназначенных для производства клетках, культивируемых до предельного клеточного возраста in vitro или дольше. Такая проверка проводится путем испытания нуклеотидной последовательности, для этих целей также могут быть использованы испытания продукта в соответствии с главой 5.2 настоящих Правил. Для нерекомбинантных клеточных линий, в которых кодирующая последовательность требуемого продукта уже была проанализирована на уровне ГБК или РБК, стабильность кодирующей белок последовательности на протяжении процесса производства должна быть подтверждена в клетках-продуцентах, культивированных до предполагаемого предельного клеточного возраста in vitro или дольше, путем либо испытания нуклеотидной последовательности, либо анализа очищенного белкового продукта.

Если продукт не может быть исследован указанным способом, для оценки стабильности клеточного субстрата можно использовать другие специфичные методы, например, установление морфологических характеристик, параметров роста, биохимических и иммунологических маркеров, прочих генотипических или фенотипических маркеров или выход требуемого продукта. В некоторых случаях, когда прямое сравнение характеристик ГБК с характеристиками клеток-продуцентов на предельном клеточном возрасте in vitro или при его превышении осуществить трудно или невозможно, для оценки стабильности клеточного субстрата на протяжении процесса производства можно сравнивать характеристики клеток на начальной стадии культивирования или производства с характеристиками клеток на предельном клеточном возрасте in vitro или при его превышении. Для подобного рода испытаний можно использовать такие показатели, как,

например, скорость потребления кислорода или глюкозы, скорость выделения аммиака или лактата. Увеличение установленного предельного для производства клеточного возраста in vitro должно быть подтверждено данными для клеток, культивирование которых продолжалось до нового предложенного предельного клеточного возраста in vitro. Для линий диплоидных клеток должны быть представлены данные, устанавливающие конечный предел продолжительности жизни клеток из РБК в условиях, идентичных используемым при производстве.

Стабильность клеток в банке клеток в установленных условиях хранения обычно подтверждают во время производства материала для клинических исследований. Данные об определении жизнеспособности законсервированных клеток должны подтвердить, что клетки пережили процесс консервации и могут быть использованы для получения требуемого продукта. Данные о производстве материалов для клинических исследований позволяют удостовериться, что из восстановленных клеток можно получить требуемый продукт. Доступные данные должны быть отражены в документах регистрационного досье. Кроме этого, должен быть представлен план мониторинга стабильности банков клеток. Предлагаемый мониторинг допускается проводить, когда один или более контейнеров банков клеток, подвергшихся консервации, оттаивают в производственных целях при надлежащем наблюдении за постоянством свойств продукта или производства или когда один или более подвергшихся криоконсервации ГБК оттаивают с целью приготовления новых РБК (при этом новые РБК должным образом квалифицированы). Если производство не проводилось в течение длительного времени, определение жизнеспособности банка клеток, используемого в качестве источника продуцирующего субстрата, должно проводиться через определенный интервал времени, указанный в регистрационном досье. Если жизнеспособность клеточного субстрата снижается незначительно, как правило, дальнейшие испытания ГБК или РБК считаются нецелесообразными.

2.3.4. Кариотипирование и исследование туморогенности.

Для оценки безопасности линии диплоидных клеток или для характеристики новой клеточной линии проводятся кариотипирование и исследование туморогенных свойств в зависимости от типа клеток, свойств продукта и производственного процесса. Применение расширенного анализа для определения относительного содержания анеуплоидных клеток считается нецелесообразным. Нет необходимости проводить кариотипирование клеточных линий грызунов или новых клеточных линий, не относящихся к диплоидным. Как указано в подразделах 2.3.1 и 2.3.2 настоящей главы, цитогенетический анализ является достаточным методом для оценки подлинности клеточного субстрата или его чистоты. Повторное испытание туморогенности на клетках с уже подтвержденным туморогенным потенциалом проводить не требуется.

Кариотипирование и исследование туморогенности для высокоочищенных продуктов, не содержащих клетки, как правило, не требуются при условии, что доказано постоянство предельного остаточного содержания ДНК клетки-хозяина по результатам валидации процесса производства либо испытания серии при выпуске.

Как правило, проведение характеристики клеточного субстрата необходимо для препаратов, в которых нельзя исключить наличие живых клеток или которые подвергаются незначительной очистке в процессе выделения (например, некоторые живые вирусные вакцины).

Целесообразность проведения исследований туморогенности и хромосомного анализа на новых клеточных субстратах для неочищенных препаратов следует оценивать в каждом конкретном случае. Возможность использования клеточных линий, обладающих известным туморогенным потенциалом или аномальным кариотипом, следует оценивать по соотношению «польза – риск» для каждого лекарственного препарата в случаях, когда он содержит клетки или когда степень его очистки невысока.

Если для производства препаратов используются генетически немодифицированные клетки MRC-5 или WI-38, нет необходимости характеризовать клеточные субстраты по кариологическим или туморогенным параметрам, поскольку эти клеточные линии достаточно охарактеризованы и результаты опубликованы. Тем не менее для каждого созданного РБК MRC-5 и WI-38 производители должны один раз подтвердить, что клетки, полученные при культивировании в условиях, аналогичных планируемому к использованию в производстве, являются диплоидными и имеют ожидаемую продолжительность жизни.

Для новых или ранее не охарактеризованных субстратов диплоидных клеток должно быть представлено подтверждение диплоидного кариотипа, а туморогенность должна быть установлена с использованием клеток из ГБК. Методы кариологического анализа и оценки туморогенности содержатся в документе ВОЗ «Требования к использованию клеток животных в качестве субстратов in vitro для производства биологических препаратов» (47-й отчет Экспертной комиссии ВОЗ по стандартизации в биологии, Женева, ВОЗ. Серия технических отчетов ВОЗ).

Приложение к главе 1 – Требования к представлению информации о первичных клеточных культурах в регистрационном досье лекарственного препарата

1. Введение

Изложенные в настоящем приложении принципы в большинстве случаев относятся к биотехнологическим (биологическим) препаратам, полученным из охарактеризованных банков клеток. Однако для производства ряда биологических лекарственных препаратов, в частности некоторых вирусных вакцин, используются первичные клеточные культуры.

Поскольку первичные клеточные культуры используются в рамках первого пассажа после создания из ткани источника, невозможно всесторонне охарактеризовать клетки до их использования, как это делается для клеточного субстрата, получаемого из банка клеток. Кроме того, биологические препараты, для производства которых используются первичные клеточные субстраты, зачастую не подвергаются интенсивной обработке (например, очистке). Несмотря на эти различия, для обеспечения пригодности и безопасности применения субстратов первичных клеток для создания биологических препаратов используется подход, во многих отношениях аналогичный изложенному в настоящих Правилах.

В настоящем приложении приводится информация, относящаяся к клеточному субстрату, которую следует включать в регистрационное досье лекарственного препарата, для производства которого используются первичные клетки. Эта информация разделяется на три основные категории:

• информация, относящаяся к источнику ткани (органа) и другим исходным материалам животного происхождения, используемым для создания первичных клеточных субстратов;
• информация, относящаяся к подготовке первичных клеточных субстратов;
• информация, относящаяся к испытаниям, проводимым на первичных клеточных субстратах с целью обеспечения безопасности препарата.

2. Источники тканей и другие исходные материалы (сырье)

В регистрационном досье должна быть представлена информация о животных, используемых в качестве источника ткани для приготовления первичного клеточного субстрата. Ткань должна быть взята у здорового животного, прошедшего ветеринарный и лабораторный контроль для подтверждения отсутствия патогенных агентов. В случаях, когда это возможно, животные-доноры должны быть выращены в закрытых, беспатогенных (SPF) колониях или стадах. Животные, используемые в качестве доноров ткани, ранее не должны использоваться для экспериментальных исследований. Прежде чем использовать животных для получения клеток, они должны пройти обязательный карантинный контроль на протяжении установленного периода времени. Производители должны получить разъяснения уполномоченных органов государств-членов по вопросам, касающимся особых требований.

Необходимо представить информацию о материалах и компонентах, используемых для получения субстратов первичных клеток, включая указание типа и источника реагентов человеческого и животного происхождения. Необходимо включить описание испытаний, проведенных с компонентами животного происхождения, чтобы удостовериться в отсутствии поддающихся обнаружению контаминантов и посторонних агентов.

3. Приготовление первичных клеточных субстратов

Необходимо описать методы, используемые для выделения клеток из ткани, создания первичных культур клеток и их поддержания.

4. Испытания первичных клеточных субстратов

Необходимо описать испытания, которые проводятся на первичных клеточных субстратах для того, чтобы оценить возможность их использования в производстве. Поскольку природа первичных клеточных субстратов исключает возможность всесторонней проверки и определения характеристик перед их использованием, параллельно проводятся испытания с целью подтверждения отсутствия в этих субстратах посторонних агентов. Таким образом, испытания в целях подтверждения отсутствия посторонних агентов в таких субстратах проводятся параллельно и могут включать в себя наблюдение за производством или неинфицированными контрольными культурами до, в ходе и после осуществления процесса производства, инокуляцию культуральной жидкости после производства и из неинфицированных контрольных культур в различные восприимчивые индикаторные клеточные культуры, способные обнаруживать широкий круг вирусов с последующим изучением цитопатических изменений и испытаниями на гемадсорбирующие вирусы, а также прочие испытания на специфичные агенты (например, значимые ретровирусы) при необходимости. Дополнительные сведения о специфичных испытаниях на вирусы описаны в соответствующих национальных (региональных, международных) руководствах.

Надлежащие режимы и методы испытаний клеток, используемых в производстве конкретных препаратов, могут варьироваться в зависимости от вида животного-донора, используемого в качестве источника ткани, от возможного наличия посторонних агентов, природы препарата, его предполагаемых показаний к применению, особенностей производственного процесса и объема испытаний, проводимых на лекарственном препарате. Заявители должны объяснять и обосновывать подходы, использованные для конкретного препарата.