Приложение № 6 Требования к валидации биоаналитических методик испытаний и анализу исследуемых биологических образцов

Table of Contents

Требования к валидации биоаналитических методик испытаний и анализу исследуемых биологических образцов

Общие положения

  1. В настоящих Требованиях представлены указания по проведению валидации биоаналитических методик, использовавшихся для определения концентрации действующего вещества в биологических жидкостях (матрицах), полученных по результатам токсикокинетических исследований и всех фаз клинических исследований. Поскольку методики связывания лиганда существенно отличаются от хроматографических аналитических методов, для валидации полимерсвязывающих методик (например, со связыванием лигандов) применяются отдельные правила, описанные в разделе V настоящих Требований.

В настоящих Требованиях описаны условия, при которых в дополнение к полной валидации биоаналитической методики необходимо провести частичную или перекрестную валидацию.

  1. Для целей настоящих Требований используются понятия, которые означают следующее:

«активные образцы» (incurred samples) – испытуемые образцы, полученные от субъектов или животных, которым вводили лекарственный препарат;

«анализируемое вещество» (analyte) – отдельное химическое соединение, подлежащее количественному определению, может представлять собой неизмененное действующее вещество, биологическую молекулу или ее производное, метаболит и (или) продукт деградации в биологическом образце;

«аналитическая методика» (analytical procedure) – подробное описание каждого этапа и способа проведения анализа;

«аналитический диапазон» (calibration range) – интервал между высокой и низкой концентрацией (содержанием) анализируемого вещества в образце (включая указанные концентрации), для которых показано, что аналитическая методика удовлетворяет требованиям по прецизионности, правильности и постоянству функции отклика;

«аналитический цикл» (analytical run) – полный комплект испытуемых образцов с соответствующим количеством градуировочных растворов и образцов для контроля качества для их валидации. В один день может быть проведено несколько циклов; один цикл может длиться в течение нескольких дней;

«верхняя граница определяемых концентраций» (upper limit of quantification (ULOQ)) – наибольшее количество анализируемого вещества в образце, которое поддается количественному определению с заранее заданной правильностью и прецизионностью;

«внутренний стандарт (ВС)» (internal standard) – контрольное соединение (например, структурно схожий аналог или соединение, меченное стабильным изотопом), добавляемое к градуировочным растворам, образцам для контроля качества и испытуемым образцам в заранее установленных постоянных концентрациях с целью поправки на экспериментальную вариабельность при пробоподготовке и анализе образцов;

«градуировочный раствор (стандарт)» (calibration standard) – биологический образец, к которому добавили известное количество анализируемого вещества. Градуировочные растворы (стандарты) используют для построения градуировочной кривой;

«нижний предел количественного определения (НПКО)» (lower limit of quantification (LLOQ)) – наименьшее количество анализируемого вещества в образце, которое поддается количественному определению с заранее заданной правильностью и прецизионностью;

«номинальная концентрация» (nominal concentration) – теоретическая или ожидаемая концентрация;

«образец для контроля качества (КК)» (quality control (QC) sample) – образец, содержащий анализируемое вещество, используемый для оценки пригодности биоаналитической методики и оценки целостности и правильности результатов анализа испытуемых образцов в неизвестной концентрации из одной серии;

«перекрестная валидация» (cross validation) – сравнение валидационных параметров двух биоаналитических методик;

«повторный анализ активных испытанных образцов» (incurred sample reanalysis) – анализ части активных испытанных образцов с целью определения, насколько сопоставимы результаты первичного анализа;

«полная валидация» (full validation) – определение валидационных параметров, подлежащих использованию для анализа каждого анализируемого вещества в образце с помощью биоаналитической методики;

«правильность» (accuracy) – выражает близость полученных с помощью методики значений к номинальным концентрациям анализируемого вещества. Правильность оценивается по величине

^                                                                             ^             полученное значение

процентной меры правильности, рассчитанной как ———————- х

истинное значение

100 %, и по относительной величине систематической погрешности;

«прецизионность» (precision) – степень разброса между сериями измерений, проведенных в заранее установленных условиях. Прецизионность характеризуется величиной относительного стандартного отклонения (отношение стандартного отклонения к среднему, выражаемое в процентах);

«селективность» (selectivity) – способность биоаналитической методики определять и различать исследуемое анализируемое вещество и внутренний стандарт в присутствии компонентов, которые могут содержаться в образце;

«специфичность» (specificity) – способность биоаналитической методики однозначно определять анализируемое вещество в присутствии других соединений (эндогенных или экзогенных) в биологическом образце;

«стабильность» (stability) – химическая стабильность анализируемого вещества в определенном образце в определенных условиях в течение определенного периода;

«стандартная операционная процедура» (Standard Operating Procedure) – документ, в котором содержится описание регулярно осуществляемых операций, значимых для качества исследования, и позволяющий проводить их правильно и единообразно;

«функция отклика» (response function) – функция, которая надлежащим образом описывает зависимость аналитического сигнала (например, площади пиков) от концентрации (содержания) анализируемого вещества в образце. Функция отклика определяется для аналитического диапазона;

«частичная валидация» (partial validation) – серии аналитических экспериментов, в которых после модификации валидированной биоаналитической методики часть параметров подвергаются валидации;

«эффект матрицы» (matrix effect) – прямое или непрямое влияние или воздействие на результаты анализа, обусловленные наличием в биологическом образце непредусмотренных анализом анализируемых веществ или иных влияющих на него веществ;

«эффект переноса» (carry over) – появление сигнала анализируемого вещества в холостом образце после проведения анализа образца с высокой концентрацией анализируемого вещества;

«якорные калибраторы» (anchor calibrators) – стандартные точки вне диапазона количественного определения, используемые с целью подбора нелинейной регрессии стандартной кривой в методах связывания лиганда.

  1. Измерение концентрации действующего вещества в биологических образцах (например, сыворотке, плазме, крови, моче и слюне) — важный аспект разработки лекарственного препарата. Поэтому в целях получения надежных результатов используемые биоаналитические методики должны быть хорошо описанными, полностью валидированными и документированными.

В особых ситуациях допускается использовать более широкие, чем описанные в настоящих Требованиях, критерии приемлемости. В этом случае, основываясь на предполагаемом использовании методики, их следует установить предварительно.

  1. Методы количественного определения концентрации биомаркеров, используемых в качестве фармакодинамических маркеров, в настоящих Требованиях не рассматриваются.

Валидация биоаналитической методики испытаний

 Требования, предъявляемые к стандартным образцам

5. Для приготовления градуировочных растворов, образцов для контроля качества и образцов для изучения стабильности в целях проведения валидации биоаналитической методики и анализа испытуемых образцов к холостому биологическому образцу (биологическому образцу, не содержащему анализируемого вещества), используя растворы стандартных образцов, добавляют исследуемые анализируемые вещества. В дополнение к этому при пробоподготовке для хроматографических методов допускается добавлять соответствующий внутренний стандарт (ВС).

  1. Необходимо удостовериться в пригодности стандартного

образца и ВС, поскольку их качество (чистота) может повлиять на результаты анализа и на результаты исследования. Поэтому стандартные образцы, используемые для валидации и анализа испытуемых образцов, должны быть получены из надежных и проверенных источников. К таким стандартным образцам относятся сертифицированные стандартные образцы, например, фармакопейные, коммерческие стандартные образцы или аттестованные стандартные образцы, приготовленные самостоятельно или внешней некоммерческой организацией. Для подтверждения чистоты и представления сведений об условиях хранения, сроке годности, номере серии стандартного образца необходим сертификат его анализа.

Если пригодность ВС подтверждена, например, отсутствием влияния анализируемого вещества и его примесей, то использование сертифицированных стандартных образцов ВС не требуется (в сертификатах анализа нет необходимости).

  1. При примененнии в качестве биоаналитического метода масс- спектрометрии (далее — МС) по возможности следует использовать стабильные меченные изотопом ВС. При этом необходимо, чтобы меченый стандарт обладал высокой изотопной чистотой и в нем не происходили реакции изотопного обмена. Необходимо провести проверку на наличие незаявленных анализируемых веществ, при обнаружении последних следует оценить возможное их влияние на валидацию биоаналитической методики.

Полная валидация биоаналитической методики

8. Любая биоаналитическая методика, независимо от того новая она или известная, подлежит полной валидации.

Основной целью валидации биоаналитической методики является подтверждение ее надежности для определения концентрации анализируемого вещества в таких биологических образцах, как кровь, сыворотка, плазма, моча и слюна. Более того, если при пробоподготовке использовался антикоагулянт, его же необходимо использовать для валидации. Полная валидация, как правило, проводится для каждого вида животных и каждой разновидности биологических жидкостей, использованных в исследовании.

Если при проведении валидации биоаналитической методики затруднительно использовать ту же разновидность биологической жидкости, которая использовалась в рамках исследования, то при достаточном обосновании допустимо использовать альтернативные биологические образцы (например, модельную спинномозговую жидкость).

  1. Основными характеристиками биоаналитической методики, необходимыми для подтверждения ее приемлемости и надежности аналитических результатов, являются селективность, нижний предел количественного определения, функция отклика и аналитический диапазон (воспроизводимость параметров градуировочной кривой), правильность, прецизионность, влияние матрицы (эффекты матрицы (полнота элюирования)), стабильность анализируемых веществ в биологических образцах и стабильность анализируемого вещества (веществ) и ВС при хранении, в рабочих растворах, в извлечениях в течение всего периода хранения и пробоподготовки.
  2. Изучению, как правило, подлежит одно анализируемое вещество или действующее вещество, но в некоторых случаях определяют концентрацию нескольких анализируемых веществ. Это могут быть как два разных вещества, так и исходное соединение с его метаболитами или энантиомеры (изомеры) действующего вещества. В таких случаях принципы валидации и анализа справедливы для всех исследуемых анализируемых веществ.

Селективность (избирательность)

  1. Биоаналитическая методика должна обладать способностью

дифференцировать анализируемое вещество и ВС от эндогенных компонентов матрицы и других компонентов образца. Селективность биоаналитической методики необходимо подтвердить, используя не менее 6 различных источников соответствующих холостых образцов, не содержащих анализируемого вещества (с экспериментальным подтверждением). В отношении редких разновидностей биологических образцов допустимо использовать меньшее количество источников. Отсутствие      искажающего       влияния компонентов холостого

биологического образца, констатируется, как правило, если их сигнал по нижнему пределу количественного определения не превышает 20 % для анализируемого вещества и 5 % – для ВС.

В некоторых случаях может понадобиться исследование степени влияния метаболитов действующего вещества, а также продуктов деградации, образующихся при пробоподготовке, и одновременно применяемых лекарственных препаратов. На этапе валидации биоаналитической методики или на этапе анализа конкретного исследования и анализируемого вещества необходимо принять во внимание лекарственные препараты, применявшиеся исследуемой популяцией как сопутствующие.

  1. Если применимо (для нестабильных метаболитов, например, кислых метаболитов в эфире, нестабильных N-оксидов или глюкуронидов, соединений с лактонной структурой), необходимо оценить возможность обратного преобразования метаболита в исходное анализируемое вещество на различных этапах анализа (включая процедуры пробоподготовки или в извлечении для МС-анализа). Необходимо установить степень обратного преобразования и проанализировать его влияние на результаты исследования. На ранних этапах разработки нового химического соединения, пока его метаболизм еще не изучен, такую оценку осуществить невозможно. Тем не менее после получения в процессе разработки новых данных о метаболизме действующего вещества необходимо учитывать проблему обратного преобразования, что требует проведения частичной валидации.

В некоторых случаях достаточно сложно получить доступ к стандартным образцам исследуемых метаболитов. С другой стороны, обратное преобразование метаболита можно оценить, проводя повторный анализ активных образцов (образцов, содержащих анализируемые вещества, взятых от субъектов исследования или животных). Однако в этом случае нельзя исключить обратное преобразование в процессе пробоподготовки.

Влияние (эффект) переноса

  1. При разработке методики необходимо принимать во внимание и минимизировать перенос анализируемого вещества от пробы к пробе. В процессе валидации необходимо оценить эффект переноса, вводя холостые образцы после образцов с высокой концентрацией или градуировочных растворов верхних уровней количественного определения. Перенос в холостой образец после стандартного раствора с высокой концентрацией не должен превышать 20 % величины нижнего предела количественного определения (НПКО), как это указано в подразделе «Нижний предел количественного определения» настоящего раздела) и 5 % – для ВС. Если очевидно, что перенос неизбежен, исследуемые образцы не рандомизируют. Для того чтобы перенос не повлиял на правильность и прецизионность, необходимо в ходе валидации предусмотреть специальные меры (например, после образцов с ожидаемой высокой концентрацией и до начала анализа очередного испытуемого образца вводить холостые образцы).

Нижний предел количественного определения

  1. Нижний предел количественного определения (НПКО) есть наименьшая концентрация анализируемого вещества в образце, которая поддается надежному количественному определению с приемлемой правильностью и прецизионностью. НПКО считается наименьшим градуировочным стандартным образцом (как это указано в подразделах «Правильность» и «Прецизионность» настоящего раздела). При этом сигнал анализируемого вещества из образца с НПКО должен не менее чем в 5 раз превосходить величину сигнала холостого образца. НПКО необходимо адаптировать к ожидаемым концентрациям и цели исследования (например, в исследовании биоэквивалентности НПКО не должен быть выше, чем 5 % от Cmax (минимальной величины Cmax из всей выборки субъектов)).

Градуировочная кривая (линейность)

  1. Необходимо оценить функцию отклика градуировочной кривой для всех концентраций анализируемого вещества, при этом изучению подлежит определенный диапазон концентраций. Градуировочные стандартные образцы готовят путем добавления анализируемого вещества с известными концентрациями к холостой пробе с использованием той же ее разновидности, которая будет получена в исследовании. Каждому анализируемому веществу, изучаемому при валидации биоаналитической методики, и каждому аналитическому циклу должна соответствовать отдельная градуировочная кривая.

В идеале до начала проведения валидации биоаналитической методики необходимо установить ожидаемый диапазон концентраций. Этот диапазон должен перекрываться аналитической областью применяемой методики, задаваемой НПКО как наименьшего градуировочного стандарта и верхним пределом количественного определения (ВПКО) как наибольшего градуировочного стандарта. Диапазон необходимо задать с целью надлежащего описания фармакокинетики изучаемого анализируемого вещества.

  1. Помимо холостого образца (подвергнутого обработке биологического образца, не содержащего анализируемого вещества или ВС) и нулевых образцов (подвергнутых обработке биологических образцов, содержащих ВС) необходимо использовать не менее 6 различных градуировочных концентрации. Каждый градуировочный стандарт допускается анализировать повторно.
  1. Необходимо использовать зависимость, которая просто и надежно позволяет описать функцию отклика аналитического сигнала от концентрации анализируемого вещества. При вычислении параметров градуировочной кривой холостые и нулевые образцы не учитывают.
  2. В отчете необходимо описать параметры градуировочной кривой (для линейной регрессии – угол наклона и свободный член (при необходимости последнего)). В дополнение к этому наряду с рассчитанными средними значениями правильности необходимо представить экспериментально рассчитанные концентрации градуировочных стандартов. В отчете необходимо представить все имеющиеся или приемлемые кривые (но не менее 3), полученные в ходе валидации.
  3. Экспериментально рассчитанные концентрации градуировочных стандартов должны лежать в пределах ± 15 % от номинальных значений (за исключением НПКО, для которых эти значения могут находиться в пределах ± 20 %). Этому критерию должны соответствовать не менее 75 % градуировочных стандартов в не менее чем 6 различных концентрациях. Если используются повторности, этим критериям (в пределах ± 15 % или ± 20 % для НПКО) должны соответствовать не менее 50 % испытанных образцов для каждой концентрации градуировочных стандартов. Если градуировочный стандарт не соответствует этим критериям, его необходимо исключить, а градуировочную кривую пересчитать без учета этого стандарта (в том числе провести повторный регрессионный анализ). Если все повторности градуировочных стандартов НПКО или ВПКО были забракованы, то валидацию соответствующей серии градуировочных растворов не проводят. При этом необходимо установить причины забраковки, а методику при необходимости доработать. Если валидация следующей серии также не проходит, то до начала новой валидации необходимо пересмотреть методику.
  1. Несмотря на то, что градуировочную кривую желательно строить с использованием свежеприготовленных образцов, при наличии надлежащих данных по стабильности допускается использовать ранее приготовленные и подвергшиеся хранению градуировочные образцы.

Правильность

  1. Правильность аналитической методики выражает близость полученных с помощью нее значений к номинальным концентрациям анализируемого вещества (как правило, она выражается в процентах). Правильность необходимо оценивать по образцам для контроля качества (КК) – образцам, к которым добавлено заранее известное количество анализируемого вещества. Образцы для КК готовят независимо от градуировочных стандартов, используя различные предварительно приготовленные исходные растворы.
  2. Образцы для КК анализируют по градуировочной кривой, экспериментальные значения концентраций сравнивают с номинальными. Правильность в отчете выражают в виде процента от номинальных значений. Правильность необходимо определять по концентрациям образцов для КК, получаемым как внутри 1 цикла (правильность внутри цикла), так и в разных циклах (правильность между циклами).

С целью оценки любых временных тенденций внутри 1 цикла целесообразно подтвердить правильность и прецизионность анализа образцов для КК не менее чем в 1 цикле, соответствующем по величине планируемому аналитическому циклу для испытуемых образцов.

Правильность внутри цикла
  1. Правильность внутри цикла определяют путем анализа внутри 1 цикла не менее 5 образцов одной концентрации не менее чем для 4 различных концентраций, входящих в диапазон применения методики. Рекомендуемые концентрации:
  • НПКО;
  • тройная величина НПКО (нижний уровень);
  • около 30 – 50 % от верхней границы определяемых концентраций (средний уровень);
  • не менее 75 % от верхней границы определяемых концентраций (верхний уровень).

Среднее значение рассчитанных концентраций должно находиться в пределах ± 15 % от номинальных значений для образцов для КК; однако для НПКО пределы допускается расширить до ± 20 % от номинальных значений.

Правильность между циклами
  1. Для валидации правильности между циклами необходимо оценить НПКО, нижний, средний и верхний уровни образцов для КК из не менее чем из 3 проанализированных циклов, проведенных в течение не менее чем 2 различных дней. Среднее значение рассчитанных концентраций должно находиться в пределах ± 15 % от номинальных значений для образцов для КК; для НПКО пределы допускается расширить до ± 20 % от номинальных значений.
  2. В отчет о валидации методики при определении правильности и прецизионности необходимо включить все полученные результаты, за исключением документированных промахов.

Прецизионность

  1. Прецизионность аналитической методики – это степень близости результатов между отдельными повторными измерениями, выражающаяся в виде относительного стандартного отклонения (коэффициента вариации). Прецизионность необходимо подтвердить для НПКО, нижнего, среднего и верхнего уровней концентрации образцов для КК как внутри 1 цикла, так и между разными циклами, то есть для тех же циклов и данных, что и при подтверждении правильности.
Прецизионность внутри цикла
  1. При оценке прецизионности внутри цикла необходимо использовать не менее 5 образцов одной концентрации для НПКО, нижнего, среднего и верхнего уровней концентрации образцов для КК внутри одного цикла. Относительное стандартное отклонение внутри 1 цикла не должно превышать 15 % для образцов для КК, для НПКО оно не должно превышать 20 %.
Прецизионность между циклами
  1. При оценке прецизионности между циклами необходимо определить НПКО, нижний, средний и верхний уровни концентраций образцов для КК не менее чем из 3 проанализированных циклов, проведенных в течение не менее чем 2 различных дней. Относительное стандартное отклонение между циклами не должно превышать 15 % для образцов для КК, для НПКО оно не должно превышать 20 %.

Отсутствие влияния разбавления образцов

  1. Степень разбавления образцов не должна влиять на параметры правильности и прецизионности методики. По возможности валидацию разбавления образцов необходимо проводить путем добавления к матрице анализируемого вещества в концентрации выше верхней границы определяемых концентраций и разведения полученного образца холостой пробой (не менее 5 определений на каждое разбавление). Правильность и прецизионность должны находиться в пределах установленных критериев приемлемости (не более ± 15 %). Аналитический диапазон (диапазон применения) должен включать в себя разбавление, применяемое к испытуемым образцам.
  2. Оценку диапазона применения можно произвести в рамках частичной валидации. Допускается использовать иную матрицу, если показано, что она не влияет на прецизионность и правильность.

Эффект матрицы

  1. При применении МС-методик необходимо оценить эффект матрицы, используя не менее 6 серий холостых образцов от разных субъектов (источников).
  2. Путем вычисления отношения максимальной площади пика в присутствии матрицы (определяется путем анализа подготовленного холостого образца с добавленной известной концентрацией анализируемого вещества) к максимальной площади пика в отсутствие матрицы (чистый раствор анализируемого вещества в той же концентрации) для каждой серии матрицы для всех анализируемых веществ и ВС необходимо рассчитать эффект матрицы (ЭМ). Необходимо рассчитать нормализованный ЭМ по ВС (как частное от деления ЭМ анализируемого вещества на ЭМ ВС). Относительное стандартное отклонение нормализованного ЭМ по ВС, рассчитанное для 6 биологических образцов, не должно превышать 15 %. Измерения осуществляют для нижнего и верхнего уровня концентраций образцов для КК.

При неприменимости такого подхода (например, при пробоподготовке в режиме реального времени) необходимо оценить вариабельность откликов между сериями путем анализа не менее 6 серий матрицы, в которую добавлено анализируемое вещество на нижнем и верхнем уровнях концентрации образцов для КК. В отчете о валидации необходимо представить площади пиков анализируемого вещества и ВС, а также рассчитанные концентрации каждого образца. Относительное стандартное отклонение для серии не должно превышать 15 %.

  1. Если матрица малодоступна, допускается использовать менее 6 различных серий матриц, однако такой подход необходимо обосновать. В этом случае также необходимо оценить эффект матрицы.
  2. Если лекарственный препарат, предназначенный для парентерального введения субъектам исследования или животным, содержит вспомогательные вещества, способные вызвать эффект матрицы (например, полиэтиленгликоль или полисорбат) эффект матрицы в дополнение к холостой матрице оценивают, используя матрицу, содержащую указанные вспомогательные вещества. Если не доказано, что указанные вспомогательные вещества подвергаются метаболизму или биотрансформации in vivo, матрицу для анализа получают от субъектов исследования или животных, которым вводили эти вспомогательные вещества. Влияние вспомогательных веществ можно оценить путем вычисления ЭМ или проведения исследования посредством разведения испытуемого образца с высокой концентрацией в холостой матрице, не содержащей вспомогательные вещества.
  3. В дополнение к стандартным биологическим образцам эффект матрицы рекомендуется оценивать на «нестандартных» образцах (например, образцах гиперлипидемической плазмы или плазмы, полученной из крови, подвергшейся гемолизу). Если анализу подлежат образцы от особых групп пациентов (например, с почечной или печеночной недостаточностью), эффект матрицы рекомендуется оценить, используя биологические образцы от таких пациентов.

Стабильность

  1. Чтобы удостовериться, что каждый этап пробоподготовки и последующего анализа образцов, а также условия их хранения не повлияли на постоянство сохранения концентрации анализируемого вещества, проводят исследование стабильности.
  2. Стабильность необходимо оценить для каждого этапа аналитической методики, то есть получить доказательства того, что условия, для которых проведены исследования стабильности (например, вид биологического образца, наличие антикоагулянта, материал контейнера (упаковки), хранение и условия анализа) аналогичны реальным условиям анализа испытуемых образцов. Ссылка на литературные источники не является достаточным условием.
  3. Стабильность анализируемого вещества в исследуемом образце

оценивают, используя образцы нижнего и верхнего уровня концентрации для КК, которые исследуют сразу после их пробоподготовки и после хранения в условиях, в которых проводится работа с испытуемыми образцами. Образцы для КК, как правило, анализируют     по      градуировочной кривой,          рассчитанной      по свежеприготовленным градуировочным растворам. Полученные концентрации сравнивают с номинальными. Правильность для каждой из концентраций (для средних значений) должна находиться в пределах ± 15 % от номинального значения.

  1. Необходимо, учитывая линейный диапазон и диапазон определения детектора, испытать стабильность исходных и рабочих растворов после соответствующих разведений.
  2. Исследования стабильности необходимо проводить при различных условиях хранения (например, используя подход «наихудшего случая»), по срокам равным или превышающим сроки хранения фактических анализируемых исследуемых образов.
  3. Необходимо провести следующие испытания стабильности:
  • а)  стабильность исходных и рабочих растворов анализируемого вещества и ВС;
  • б) стабильность замороженного и размороженного биологического образца, содержащего анализируемое вещество (перемещенного из условий заморозки в комнатную температуру или температуру условий пробоподготовки не менее чем в 3 циклах «замораживания – размораживания»);
  • в)  краткосрочная стабильность анализируемого вещества в биологическом образце при комнатной температуре или температуре условий пробоподготовки;
  • г)  естественное хранение биологического образца, содержащего анализируемое вещество (в замороженном виде).
  1. Кроме того необходимо провести следующие испытания (если применимо):
  • а)  стабильность образца после пробоподготовки при комнатной температуре или в условиях хранения, которые будут использоваться во время анализа;
  • б)  стабильность подвергшихся пробоподготовке образцов в устройстве для автоматического ввода пробы при температуре инжектора или автодозатора.
  1. Изучение стабильности при замораживании и размораживании. Образцы для КК хранят замороженными в морозильной камере при предусмотренной температуре и затем размораживают при комнатной температуре или температуре пробоподготовки. После полного размораживания образцы заново замораживают в тех же условиях. В каждом цикле образцы должны находиться в замороженном состоянии в течение по меньшей мере 12 часов. Количество циклов изучения стабильности «замораживания – размораживания» должно быть равным или превышать количество таких циклов для испытуемых образцов.
  2. Изучение естественного хранения замороженного биологического образца, содержащего анализируемое вещество. Образцы для КК необходимо заморозить в тех же условиях и хранить в таких условиях столько же, сколько и испытуемые образцы, или дольше. В отношении низкомолекулярных органических соединений допускается использовать подход, основанный на исследовании крайних вариантов (метод брекетинга), например, если стабильность подтверждена при температурах минус 70 и минус 20 °С, исследовать стабильность при температурах, попадающих в этот диапазон, не требуется. Стабильность крупных молекул (например, пептидов и белков) необходимо подтвердить для каждой из температур, при которых будет осуществляться хранение биологических образцов. В дополнение к образцам для КК допускается использовать испытуемые образцы, однако использование только испытуемых образцов является недостаточным, поскольку номинальные концентрации анализируемого вещества в них неизвестны. Результаты изучения стабильности при естественных условиях хранения должны быть получены до составления отчета.
  3. Изучение стабильности исходных и рабочих растворов. Подтверждать стабильность рабочих растворов для каждой концентрации не требуется, допускается ограничиться подтверждением стабильности крайних вариантов (методом брекетинга). Подтверждать стабильность внутренних стандартов, меченных стабильными изотопами, не требуется, если подтверждено, что в условиях, для которых подтверждена стабильность анализируемого вещества, не происходит реакций изотопного обмена.
  4. В отношении исследования с несколькими анализируемыми веществами, включая отдельные исследования биоэквивалентности, необходимо подтвердить стабильность каждого анализируемого вещества в биологическом образце, содержащем все анализируемые вещества.
  5. В целях подтверждения того, что определяемые аналитической методикой концентрации анализируемого вещества отражают его истинное содержание в биологических образцах субъекта исследования в момент их отбора, необходимо изучить стабильность анализируемого вещества в биологическом образце, полученном сразу после отбора образцов и в течение последующей пробоподготовки вплоть до помещения его в условия хранения. Необходимость подтверждения такой стабильности следует рассматривать в частном порядке, ориентируясь на химическую структуру анализируемого вещества.

Частичная валидация

  1. При незначительных изменениях ранее валидированной аналитической методики (в зависимости от характера таких изменений) в проведении полной валидации, как правило, нет необходимости. К изменениям, в отношении которых допускается проведение частичной валидации, относятся трансфер биоаналитической методики в другую лабораторию, замена оборудования, изменение диапазона применения, ограниченный объем биологических образцов, изменение разновидности биологического образца или вида животного, замена антикоагулянта, изменение процедуры пробоподготовки, условий хранения и др. В отчете необходимо отразить все произошедшие изменения и обосновать объем повторной или частичной валидации.

Объем частичной валидации может предполагать объем работ начиная с минимального объема, заключающегося только в выполнении оценки прецизионности и правильности внутри цикла, и заканчивая проведением полной валидации.

Перекрестная валидация

  1. Если данные получены с помощью разных методов (методик) в рамках группы исследований или в рамках одного исследования в различных лабораториях с использованием одной и той же методики, необходимо сравнить полученные данные и провести перекрестную валидацию использованных методов (методик). В рамках многоцентрового исследования различия в пробоподготовке или использование иного аналитического метода может привести к различным результатам. По возможности перекрестную валидацию необходимо провести до анализа испытуемых образцов. В рамках перекрестной валидации необходимо провести анализ образцов для КК или испытуемых образцов с помощью всех использованных аналитических методов (методик). Полученные с помощью различных методов (методик) средние значения правильности для образцов для КК не должны различаться более чем на ± 15 %, однако при достаточном обосновании они могут различаться на большую величину. Погрешность между двумя значениями испытуемых образцов должна укладываться в диапазон 20 % от их среднего значения не менее чем для 67 % повторностей.

III. Анализ испытуемых образцов

  1. По завершении полной валидации аналитической методики приступают к анализу испытуемых образцов. До начала анализа испытуемых образцов необходимо провести проверку пригодности биоаналитической методики.
  2. С целью обеспечения приемлемости аналитического цикла пробоподготовку испытуемых образцов, образцов для КК и градуировочных растворов необходимо осуществлять в соответствии с валидированной аналитической методикой.

Аналитический цикл

52. Аналитический цикл состоит из холостого образца (подвергнутого обработке биологического образца, не содержащего анализируемого вещества или ВС) и нулевого образца (подвергнутого обработке биологического образца, содержащего ВС), градуировочных растворов не менее чем в 6 концентрациях, образцов для КК не менее чем в 3 концентрациях (нижний, средний и верхний уровни) в 2 повторностях (или не менее 5 % от количества испытуемых образцов в зависимости от того, что больше) и испытуемых образцов, подлежащих анализу. Если номинальные концентрации исходных растворов не установлены, градуировочные растворы и образцы для КК необходимо готовить отдельно, используя разные приготовленные исходные растворы. Все образцы (градуировочные растворы, образцы для КК и испытуемые образцы) подлежат пробоподготовке как единая серия образцов в порядке, в котором они должны анализироваться. Единая серия представляет собой образцы, подлежащие пробоподготовке в одно и то же время, то есть последовательной непрерывной обработке одним и тем же аналитиком с использованием одинаковых реактивов в сходных условиях. Следует избегать анализа раздельно приготовленных образцов в качестве нескольких серий в одном аналитическом цикле. Если этого избежать не удается (например, вследствие ограничений по стабильности при пробоподготовке) то каждая серия должна включать в себя образцы для КК как минимум 3 уровней концентрации (нижнего, среднего и верхнего). В стандартной операционной процедуре (далее – СОП) или рабочих документах по исследованию необходимо заранее установить критерии приемлемости для всего аналитического цикла и его отдельных серий.

53. В целях снижения вариабельности результатов анализ всех образцов от 1 субъекта в исследованиях биоэквивалентности рекомендуется осуществлять в рамках 1 аналитического цикла. Образцы для КК необходимо распределить по циклу таким образом, чтобы доказать правильность и прецизионность для всего цикла.

Критерии приемлемости аналитического цикла

54. В протоколе, плане исследования или в СОП необходимо установить критерии приемлемости или неприемлемости аналитического цикла. Если весь цикл состоит из нескольких серий, критерии приемлемости должны распространяться на весь цикл и (или) на каждую серию в отдельности. Цикл может быть приемлемым несмотря на неприемлемость серии в связи с несоблюдением критериев.

55. Необходимо установить следующие критерии приемлемости аналитического цикла:

а)  экспериментально рассчитанные концентрации градуировочных

растворов должны находиться в пределах ± 15 % от номинальных значений (за исключением НПКО, для которых эти значения могут находиться в пределах ± 20 %). Этому критерию должны соответствовать не менее 75 % градуировочных растворов, как минимум для 6 различных концентраций. Если результат для градуировочного раствора не соответствует этим критериям, этот результат должен быть исключен, а градуировочная кривая должна быть пересчитана без учета этого результата (повторный регрессионный анализ). Если отклоненный результат относится к градуировочному раствору с уровнем НПКО, то для такого аналитического цикла в качестве НПКО будет служить следующий наименьший приемлемый градуировочный раствор из диапазона линейности. Если результат для градуировочного раствора с максимальной концентрацией  неприемлем, то для такого аналитического цикла в качестве ВПКО будет служить следующий наибольший приемлемый градуировочный раствор из диапазона линейности. Пересчитанный  аналитический диапазон должен охватывать все образцы для КК (нижнего, среднего и верхнего уровня);

б) значения правильности образцов для КК должны лежать в пределах ± 15 % от номинальных значений. Этому критерию должны соответствовать не менее 67 % образцов для КК и не менее 50 % образцов для каждой концентрации. Если эти критерии не соблюдаются, аналитический цикл необходимо забраковать, а исследуемые образцы подвергнуть повторной пробоподготовке и анализу. При одновременном определении нескольких анализируемых веществ каждому из них должна соответствовать отдельная градуировочная кривая. Если аналитический цикл по одному из анализируемых веществ является приемлемым, но неприемлемым по другому, допускается использовать данные по концентрации приемлемого анализируемого вещества, однако для определения концентрации отклоненного анализируемого вещества образцы необходимо подвергнуть повторной пробоподготовке и анализу.

  1. Если при повторном использовании градуировочных растворов один из них – НПКО или ВПКО – оказывается неприемлемым, аналитический диапазон методики не меняется.
  2. Для каждой концентрации образцов для КК необходимо рассчитать средние значения правильности и прецизионности всех принятых циклов и включить их в аналитический отчет. Если средние значения правильности и значения прецизионности превышают 15 %, необходимо провести дополнительное расследование с целью объяснения таких отклонений. Подобные результаты при исследованиях биоэквивалентности могут привести к неприемлемости данных.

Аналитический диапазон (Calibration range)

58. Если до начала анализа испытуемых образцов известно или ожидается, что диапазон концентраций анализируемого вещества в испытуемых образцах будет узким, то в целях надежного расчета концентраций в испытуемых образцах рекомендуется либо сузить аналитический диапазон и адаптировать концентрации образцов для КК к нему, либо включить новые образцы для КК с соответствующими концентрациями.

59. Если узкого диапазона результатов анализа не ожидается, но он наблюдается после начала анализа образцов, рекомендуется остановить анализ и либо сузить установленный аналитический диапазон с пересмотром существующих концентраций образцов для КК, либо перед возобновлением анализа испытуемых образцов включить в аналитический диапазон образцы для КК с дополнительными концентрациями. Повторный анализ образцов, проанализированных до оптимизации аналитического диапазона или концентраций образцов для КК, не требуется.

60. Правило, указанное в пункте 59 настоящих Требований также применимо, если выясняется, что большое количество концентраций анализируемого вещества в испытуемых образцах превышает верхнюю границу определяемых концентраций. В этом случае по возможности необходимо расширить аналитический диапазон и включить дополнительные образцы для КК или изменить их концентрацию.\

61. В диапазон концентраций, установленный для испытуемых образцов, должны входить не менее 2 концентраций образцов для КК. Если аналитический диапазон изменяется, в целях расчета функции отклика и подтверждения правильности и прецизионности биоаналитическая методика подлежит повторной (частичной) валидации.

Повторный анализ испытуемых образцов

62. До начала анализа образцов в протоколе валидации, плане анализа или СОП необходимо установить возможные причины повторного анализа испытуемых образцов и критерии выбора значений, подлежащих включению в аналитический отчет. В отчете об исследовании необходимо обосновать количество образцов (и их долю от общего количества), подвергшихся повторному анализу.

63. Повторный анализ испытуемых образцов, может проводиться в том числе по следующим причинам:

  • а)  забраковка аналитического цикла вследствие невыполнения критериев приемлемости в отношении правильности градуировочных растворов и (или) образцов для КК;
  • б)  аналитический сигнал ВС значительно отличается от сигнала, полученного для градуировочных растворов и образцов для КК (если такие критерии заранее установлены в СОП);
  • в) ошибки    при введении образцов или неисправность аналитического оборудования;
  • г)  наличие циклов, в которых:
  • градуировочный образец с нижним уровнем был исключен из градуировочной кривой;
  • рассчитанные концентрации превышают верхнюю границу определяемых концентраций;
  • рассчитанные концентрации находятся ниже НПКО для данного цикла, что привело к увеличению его НПКО по сравнению с другими циклами;
  • д)  обнаружение анализируемого вещества в биологическом образце, полученном до приема (введения) лекарственного препарата, или в холостых образцах на уровнях НПКО;
  • е) несоответствие критериям приемлемости при проверке пригодности хроматографического анализа.
  1. Повторный анализ испытуемых образцов по фармакокинетическим причинам в исследованиях биоэквивалентности является, как правило, неприемлемым, поскольку он может повлиять на результаты исследования и исказить их. В этом случае повторный анализ можно рассматривать как часть лабораторного расследования с целью выявления возможных причин аномальных результатов и предотвращения возникновения подобных проблем в будущем.
  2. Если повторный анализ проведен вследствие обнаружения анализируемого вещества в биологических образцах полученных до приема (введения) лекарственного препарата или по фармакокинетическим причинам, необходимо описать образцы, подвергнутые повторному анализу, и представить данные о начальных значениях, причинах повторного анализа, значениях, полученных в ходе повторного анализа и указать принятые в итоге значения и обоснования приемлемости.
  3. Если в ходе валидации доказана удовлетворительная прецизионность для повторной инжекции и стабильность подготовленных образцов в устройстве для автоматического ввода проб, при неисправности оборудования допускается повторная инжекция образцов. Повторная инжекция всего аналитического цикла или отдельных образцов градуировочных растворов или образцов для КК в силу элементарного брака при градуировке либо образцов для КК без какой-либо установленной аналитической причины недопустима.
  4. Безопасность субъектов исследования должна превалировать над любыми другими аспектами исследования. Поэтому при ее обеспечении могут возникнуть иные обстоятельства, требующие повторной пробоподготовки и (или) повторного анализа отдельных испытуемых образцов (например, если обнаружены неожиданные или резко выделяющиеся результаты, которые могут повлиять на безопасность пациента).

Интегрирование (обработка хроматограмм)

68. В СОП необходимо описать интегрирование и повторное интегрирование хроматограмм. В аналитическом отчете необходимо объяснить все отклонения в выполнении процедур от данного СОП. Параметры интегрирования хроматограмм и при повторном интегрировании начальные и конечные данные интегрирования необходимо вносить в документы лаборатории и представлять по запросу.

Повторный анализ активных испытанных образцов

69. Использование градуировочных растворов и образцов для КК во время валидации не всегда имитирует реальные испытуемые образцы. Различия в ходе пробоподготовки и хранения образцов (например, в связывании с белками, обратное преобразование известных и неизвестных метаболитов, неоднородность (гетерогенность) образцов или применение сопутствующих лекарственных препаратов) могут повлиять на правильность и прецизионность определения анализируемого вещества в таких образцах. Следует оценивать правильность активных испытанных образцов посредством их повторного анализа в отдельных циклах в другие дни. Объем исследования зависит от свойств анализируемого вещества и испытуемых образцов и должен основываться на аналитической методике (методе) и природе анализируемого вещества. Тем не менее следует ориентироваться на следующее правило: если количество образцов не превышает 1000, повторному анализу подлежит 10 % испытуемых образцов, а если оно превышает 1000 то 5 % от общего числа испытуемых образцов. Следует использовать образцы, соответствующие Cmax и фазе элиминации.

70. Относительная погрешность между исходно полученной концентрацией и концентрацией, полученной при повторном анализе, не должна превышать 20 % в не менее чем 67 % случаев. Относительная погрешность рассчитывается по следующей формуле:

^                                                                 (повторное значение-исходное значение) . Л/

Относительная погрешность =————————————- X 100 %

среднее значение

Относительная погрешность, превышающая 20 %, может указывать на аналитические погрешности и подлежит расследованию.

  1. Если при анализе активных испытанных образцов выявлены разнородные результаты, необходимо установить их причины и принять надлежащие меры по минимизации неудовлетворительной правильности (и прецизионности).
  2. Повторный анализ активных испытанных образцов необходимо осуществлять, как минимум, в следующих случаях:
  • а)  при проведении токсикокинетических исследований для каждого вида животных;
  • б)  во всех опорных (регистрационных) исследованиях биоэквивалентно сти;
  • в)  во всех клинических исследованиях, впервые проводимых у человека;
  • г)  во всех клинических исследованиях, впервые проводимых у пациентов;
  • д)  во всех клинических исследованиях, впервые проводимых у пациентов с печеночной и (или) почечной недостаточностью.

Повторный анализ активных испытанных образцов при проведении исследований на животных допускается проводить только в исследованиях ранней фазы при условии, что такой анализ является репрезентативным для опорных исследований относительно введенной дозы лекарственного препарата и полученной концентрации анализируемого вещества.

  1. Образцы не подлежат смешиванию друг с другом, поскольку это может ограничить выявление резко выделяющихся результатов.

Полимерсвязывающие методы (методы связывания лиганда)

Стандартные образцы

74. Макромолекулы являются гетерогенными, поэтому их активность и иммунореактивность могут варьироваться. Стандартный материал должен быть хорошо описан и документирован (например, должен иметь сертификат анализа и документы, подтверждающие происхождение стандартного материала). Необходимо использовать наиболее чистый стандартный образец из доступных. При приготовлении градуировочных стандартов и образцов для КК рекомендуется использовать серию стандартного образца, которая использовалась в при проведении доклинических и клинических исследований. При смене серии стандартного образца перед ее использованием необходимо провести описание ее аналитических характеристик и оценить ее биоаналитическую пригодность, чтобы удостовериться, что функциональные свойства метода (методики) не нарушены.

Валидация методики

75. При изучении фармакокинетики лекарственных препаратов на основе макромолекул наиболее часто используются методы, основанные на связывании лиганда (МСЛ), или иммунохимические методы. Принципы валидации и рекомендации по анализу испытуемых образцов следует применять и к МСЛ. Однако такие методики могут создавать затруднения при проведении их валидации. Ввиду присущих макромолекулам свойств и их сложной структуры процесс пробоподготовки (извлечения) затруднителен, поэтому анализ, как правило, проводят без предварительного выделения анализируемого вещества. Кроме того, эти методики не позволяют непосредственно определить содержание (концентрацию) самих макромолекул, а косвенно измеряют результат реакции связывания макромолекул с реактивами, использующимися в методе (методике).

Полная валидация

Специфичность
  1. Под специфичностью связывания с реактивами понимается способность реактивов связываться исключительно с изучаемым анализируемым веществом. Специфичность связана с концепцией перекрестной реактивности. Теоретически связывающий реактив должен быть специфичным и не должен обладать перекрестной реактивностью со «структурно родственными соединениями» (например, эндогенными соединениями, изоформами, вариантными формами анализируемого вещества и аналогичными по физико­химическим свойствам соединениями) и лекарственными препаратами, сопутствующий прием которых вероятен субъектами исследования. При разработке метода и его валидации, такие «структурно родственные соединения» как правило отсутствуют. Изучение специфичности допускается осуществлять после завершения валидации и накопления данных о свойствах анализируемого вещества. Специфичность следует испытывать с использованием образцов для КК, посредством прибавления в биологические образцы, никогда ранее не содержавшие действующего вещества (биологические образцы, полученные от животных или субъектов, которым никогда не вводили анализируемое вещество), возрастающих концентраций доступных «структурно родственных молекул» или лекарственных препаратов, которые, как ожидается, будут применяться одновременно, а также посредством определения правильности методики при анализе рассматриваемой макромолекулы как на уровнях НПКО, так и верхней границы определяемых концентраций. Критерии приемлемости методики для образцов для КК должны находиться в пределах ± 25 % от номинальных значений.
Селективность
  1. Под селективностью методики связывания лиганда понимается способность определять рассматриваемое анализируемое вещество в присутствии неродственных соединений в биологическом образце. Ввиду присущих макромолекулам свойств их извлечение, как правило, не проводят. В связи с этим, неродственные соединения, содержащиеся в биологическом образце (например, ферменты, осуществляющие деградацию макромолекул, гетерофильные антитела или ревматоидный фактор) могут оказывать влияние на результат количественного определения при данном анализе. Селективность испытывают посредством прибавления не менее 10 источников биологических образцов на уровне НПКО или близком к нему. Такие источники должны включать гиперлипидемические и гемолизированные образцы. Следует включить в испытание источники биологических образцов, полученные у популяции пациентов с соответствующим заболеванием. Селективность следует изучить на уровне НПКО или близком к нему. Также целесообразно изучить селективность при более высоких концентрациях анализируемого вещества. Если влияние носит концентрационно зависимый характер, необходимо установить минимальную концентрацию, при которой такое влияние значимо. Значения правильности методики должны находиться в пределах ± 20 % (± 25 % при НПКО) от номинальной концентрации в по меньшей мере 80 % изученных биологических образцов.
Эффект переноса
  1. При использовании автоматизированных дозирующих устройств необходимо изучить возможность переноса в образцы анализируемого вещества посредством помещения холостых образцов после образцов с высокой концентрацией анализируемого вещества или градуировочного стандарта верхней границы определяемых концентраций
Выбор разновидности биологического образца
  1. Ввиду значительного влияния высоких концентраций структурно родственных эндогенных соединений на результат анализа определение некоторых макромолекул без предварительного их извлечения из сложных биологических образцов невозможно. Несмотря на то что использование извлечений из биологических образцов (например, с использованием сорбции на угле, иммуноаффинных сорбентов) или альтернативных матриц (например, модельных белковых буферных растворов, диализированной сыворотки) не рекомендуется, в некоторых случаях это является вынужденной мерой, поскольку иная стратегия определения рассматриваемого анализируемого вещества отсутствует. Градуировочную стандартную кривую допускается строить с помощью таких «модельных образцов». Образцы для КК следует готовить в фактическом биологическом образце с оценкой правильности, подтверждающей отсутствие эффекта матрицы.
Минимально необходимое разведение
  1. Поскольку биологические образцы могут давать высокий фоновый сигнал, может потребоваться определение минимально необходимого разведения. Под минимально необходимым разведением понимается наименьшее разведение, до которого следует развести образец в буферном растворе для оптимизации правильности и прецизионности аналитического цикла пеосредством снижения соотношения «аналитический сигнал-фоновый сигнал». Для определения минимально необходимого разведения образцы следует готовить в той же разновидности биологического образца, что и испытуемые образцы.
Градуировочная кривая
  1. При построении градуировочной кривой зависимость косвенно измеряемого сигнала от концентрации, как правило, является нелинейной, обычно сигмовидной. Следует использовать по меньшей мере 6 градуировочных стандартов в не менее чем 2 повторностях. Градуировочные стандарты следует приблизительно равномерно распределить на логарифмической шкале в пределах ожидаемого аналитического диапазона. Помимо градуировочных стандартов, для построения кривой можно использовать якорные точки, лежащие вне области аналитического диапазона. В ходе валидации следует изучить по меньшей мере 6 независимых градуировочных циклов. Чтобы установить совокупную         устойчивость         регрессионной модели

градуировочной кривой, результаты следует проанализировать в виде таблицы. Допускается исключать градуировочный стандарт из кривой вследствие технической ошибки (промаха) при выявлении ее причины (например, ошибка отмеривания дозатором). Целевые концентрации градуировочных стандартов, рассчитанные из градуировочной кривой методом пересчета, должны находиться в пределах ± 20 % от номинального значения (± 25 % для НПКО и верхней границы определяемых концентраций) для не менее чем 75 % проанализированных градуировочных стандартов. Якорные калибраторы не требуют установления критериев приемлемости, поскольку они не входят в область аналитического диапазона.

Прецизионность и правильность
  1. Для оценки прецизионности и правильности не следует использовать свежеприготовленные образцы для КК, их необходимо предварительно заморозить и работать с ними также, как при анализе испытуемых образцов. Для оценки правильности, прецизионности и общей ошибки метода (методики) следует использовать по меньшей мере 5 образцов для КК (ожидаемый уровень НПКО, уровень не более, чем в 3 раза превышающий НПКО, средний уровень, верхний уровень и ожидаемую верхнюю границу определяемых концентраций). Валидация должна имитировать реальный анализ испытуемых образцов, то есть если в соответствии с рекомендациями испытуемые образцы подвергаются двукратному определению (например, с использованием 2 лунок), то в ходе валидации образцы для КК следует подвергать двукратному анализу (то есть с использованием 2 лунок на каждый образец для КК). Измерения следует проводить по меньшей мере в 6 независимых аналитических циклах в течение нескольких дней. В отношении правильности внутри цикла и между циклами средние значения концентраций должны укладываться в ± 20 % от номинального значения для каждого уровня (± 25 % для НПКО и верхней границы определяемых концентраций). Более того, общая ошибка (то есть сумма абсолютного значения относительной ошибки, выраженной в процентах, и коэффициента вариации, выраженного в процентах) не должна превышать 30 % (40 % для НПКО и верхней границы определяемых концентраций)
Линейность разведения образцов
  1. Ввиду узости аналитического диапазона кривой градиуровочного стандарта необходимо, используя образцы для КК, подтвердить, что рассматриваемое анализируемое вещество, присутствующее в концентрациях, превышающих область количественного определения (выше верхней границы определяемых концентраций), можно точно измерить с помощью методики после разведения образца холостой матрицей, чтобы получить концентрации анализируемого вещества, укладывающиеся в валидированный аналитический диапазон. Дополнительной причиной проведения экспериментов с разведением служит обнаружение потенциальных прозон или «эффекта сползания», то есть подавления сигнала, обусловленного высокими концентрациями анализируемого вещества. Концентрация для каждого разведения, вычисленная методом пересчета, должна находиться в пределах ± 20 % от номинального значения концентрации после поправки на разведение, прецизионность конечных концентраций всех разведений не должна превышать 20 %.
Параллелизм
  1. При наличии испытуемых образцов в целях выявления возможного эффекта матрицы или различающейся аффинности к метаболитам необходимо оценить параллелизм между соответствующими значениями на градуировочной кривой и результатами испытуемых образцов, подвергшихся серийному разведению. Испытуемый образец с высокой концентрацией (предпочтительно, близкой к Cmax) следует развести с помощью холостого образца минимум в 3 раза. Прецизионность между образцами в сериях разведений не должна превышать 30 %. Если образцы разведены нелинейно (непараллельно), необходимо заранее определить процедуру представления результатов. Если в ходе валидации метода (методики) испытуемые образцы недоступны, параллелизм следует изучить, как только испытуемые образцы станут доступны.
Стабильность
  1. Стабильность анализируемого вещества изучают, используя образцы для КК с низкими и высокими уровнями концентраций с помощью способа, указанного в подразделе «Стабильность» раздела 2 части II настоящих Требований. Как указывалось ранее, при изучении стабильности необходимо установить краткосрочную стабильность при комнатной температуре или температуре пробоподготовки и стабильность при «замораживании-размораживании». Кроме того, следует изучить естественную стабильность в замороженном состоянии при каждой температуре, при которой будут храниться образцы.
  2. Среднее значение каждой концентрации должно находиться в пределах ± 20 % от номинального значения.
Реактивы
  1. Ключевые реактивы, включая связывающие реактивы (например, связывающие белки, аптамеры, антитела или конъюгированные антитела), а также реактивы, содержащие соединения с ферментативной активностью, оказывают прямое влияние на результаты анализа, вследствие чего необходимо обеспечить их качество. Соответственно, при изменении серии реактива в ходе валидации методики или анализа образцов необходимо подтвердить правильность аналитических функций метода (методики), чтобы убедиться, что она после использования исходной или предыдущей серии не нарушалась.
  2. В целях обеспечения отсутствия влияния на аналитические функции метода (методики) во времени необходимо документировать условия, гарантирующие поддержание стабильности как второстепенных реактивов (например, буферных растворов, растворителей и модификаторов значений рН), так и, что более важно, ключевых реактивов (реагентов).
Коммерческие наборы
  1. Коммерческие наборы необходимо повторно валидировать, чтобы обеспечить правильность и прецизионность при анализе образцов уровня НПКО и образцов для КК в аналитическом диапазоне, который будет использоваться для анализа испытуемых образцов. Применяются принципы валидации, указанные в настоящем подразделе Требований.

Частичная валидация и перекрестная валидация

90. Все требования к валидации, рассмотренные в подразделах 3 и 4 части II настоящих Требований применимы к МСЛ.

Анализ испытуемых образцов
Аналитический цикл

91. Наиболее часто при МСЛ используется планшет для микропроб. Аналитический цикл может состоять из нескольких планшетов, однако каждый из них должен содержать отдельный комплект градуировочных стандартов и образцов для КК для компенсации различия между характеристиками планшетов. Некоторые платформы вмещают ограниченное количество образцов. В связи с этим допустимо помещать комплект градуировочных стандартов в первую и последнюю платформы, а образцы для КК размещать в каждой платформе.

92. Рекомендуется анализировать испытуемые образцы по меньшей мере в 2 повторностях.

Критерии приемлемости анализа испытуемых образцов
  1. Концентрации градуировочных стандартов, вычисленные методом пересчета, должны находиться в пределах ± 20 % от номинального значения их концентрации (за исключением НПКО и верхней границы определяемых концентраций, которые должны укладываться в ± 25 %). Этот критерий должен выполняться по меньшей мере для 75 % проанализированных градуировочных стандартов, минимальное количество которых для установления аналитического диапазона должно быть не менее 6. Данное требование не распространяется на якорные калибраторы.
  2. Каждый планшет должен включать не менее 3 концентраций образцов для КК (низкого, среднего и верхнего уровня) по меньшей мере в 2 повторностях. Кроме того, при валидации образцы для КК должны имитировать анализ испытуемых образцов по количеству лунок на каждый испытуемый образец. По меньшей мере 67 % проанализированных образцов для КК и 50 % образцов каждой концентрации должны укладываться в диапазон ± 20 % от номинального значения. Все несоответствия данному критерию необходимо обосновать.
Повторный анализ активных испытанных образцов
  1. Все вопросы, касающиеся повторного анализа ранее испытанных образцов и рассмотренные в подразделе 4 раздела III настоящих Требований, применимы и к методикам связывания лиганда. Концентрации, полученные при первичном и повторном анализах, должны находиться в пределах ± 30 % от их среднего значения для не менее чем 67 % повторов.

Отчетность

96. В отчет (отчеты) о валидации и аналитический отчет (отчеты) необходимо включить сведения о проведенных аудитах (инспекциях), если таковые проводились.

Отчет о валидации

97. При высокой детализации сведений, содержащихся в отчете о валидации, достаточно указать ссылки на СОП по соответствующим процедурам, необходимым для анализа. В противном случае данные СОП необходимо приложить к отчету о валидации.

Все первичные документы должны быть доступны в их исходном формате по запросу эксперта.

Все отклонения от протокола валидации необходимо документировать.

  1. Минимальные требования к содержанию отчета о валидации:
  • а)  резюме валидации;
  • б)  описание использованной аналитической методики и, если применимо, ее источник (ссылки на источники литературы для разработки методики и (или) модификация методики);
  • в)  описание методики количественного определения (анализируемое вещество, ВС, пробоподготовка, анализ);
  • г)  стандартные образцы (происхождение, номер серии, сертификат анализа, стабильность и условия хранения);
  • д)  градуировочные растворы (стандарты) и образцы для КК (разновидность биологического образца, антикоагулянт (если применимо), приготовление градуировочных растворов с указанием дат и условий хранения);
  • е)   критерии приемлемости цикла;
  • ж)  результаты анализа:
  • – таблица с перечислением всех выполненных аналитических циклов с указанием дат и приемлемости или неприемлемости цикла с описанием причин неприемлемости цикла;
  • – таблица с перечислением результатов градуировки всех приемлемых аналитических циклов, включая аналитический диапазон, функцию отклика, экспериментально рассчитанные концентрации и значения правильности;
  • – таблица результатов анализа образцов для КК всех приемлемых аналитических циклов (прецизионность и правильность внутри цикла и между циклами), необходимо четко обозначить значения, находящиеся вне критериев приемлемости;
  • – данные о стабильности исходных и рабочих растворов, образцов для КК, охватывающие использованные условия хранения;
  • – данные о селективности, НПКО, эффекте переноса, эффекте матрицы (если применимо) и линейности;
  • з)  непредвиденные результаты, полученные в ходе валидации с полным обоснованием принятых мер;
  • и)  отклонения от методики и (или) СОП (описание отклонений, влияние их на результаты исследования, дополнительные данные).
  1. В отчете о валидации необходимо указать результаты всех отдельных измерений, проведенных для градуировочных растворов (стандартов) и образцов для КК.

Аналитический отчет о проведенном исследовании

100. В аналитический отчет о проведенном исследовании необходимо включить ссылку на отчеты о валидации, соответствующие анализу испытуемых образцов. Кроме того, в нем необходимо представить подробное описание анализа испытуемых образцов.

101. При высокой детализации сведений, отражаемых в аналитическом отчете, достаточно указать ссылки на СОП по соответствующим процедурам, необходимым для анализа. В противном случае данные СОП необходимо приложить к отчету

102. Все первичные документы должны быть доступны в их исходном формате по запросу эксперта.

103.В аналитическом отчете необходимо описать все отклонения от плана анализа, аналитической методики или СОП.

104. Минимальные требования к содержанию аналитического отчета о проведенном исследовании:

  • а)  стандартные образцы (происхождение, номер серии, сертификат анализа, стабильность и условия хранения);
  • б)  градуировочные растворы (стандарты) и образцы для КК (условия хранения);
  • в)  критерии приемлемости цикла (краткое описание, ссылка на соответствующий протокол или СОП);
  • г)   описание количественного определения (краткое описание);
  • д)  схема движения образцов (даты приема и содержание, состояние образцов при приеме, место и условия хранения (если применимо));
  • е)   результаты анализа испытуемых образцов:
  • состав аналитического цикла:
  • таблица с перечислением всех аналитических циклов и исследуемых образцов с указанием дат и результатов;
  • таблица с перечислением результатов градуировки всех приемлемых аналитических циклов;
  • таблица с перечислением результатов анализа образцов для КК всех приемлемых аналитических циклов; необходимо четко обозначить значения, находящиеся вне критериев приемлемости;
  • забракованные аналитические циклы (идентификационные данные, дата анализа, причины брака);
  • ж)  отклонения от методики и (или) СОП (описание отклонений, влияние на результат исследования, дополнительные данные);
  • з)   повторный анализ, за исключением повторного анализа по таким аналитическим причинам, как забракованный цикл (таблица идентификации образцов, причины повторного анализа, первичные значения и значения, полученные при повторном анализе).
  1. Результаты повторного анализа активных испытанных образцов допускается представить в отчете о валидации или в аналитическом отчете в отдельном приложении.
  2. К аналитическому отчету об исследовании биоэквивалентности необходимо приложить хроматограммы из полных аналитических циклов, так чтобы они включали не менее 20 % субъектов, а также соответствующие образцы для КК и градуировочные растворы (стандарты).

В аналитическом отчете прочих исследований необходимо представить репрезентативные хроматограммы. Дополнительные хроматограммы должны быть доступны по запросу.