Table of Contents

ОФС.1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Бактериальные ОФС.1.2.4.0006.15
эндотоксины Взамен ГФ XII, ч.1 ОФС 42-0062-07

Настоящая статья описывает методы определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения и фармацевтических субстанциях, используемых для их изготовления.

Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив). ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами. В результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина.

Существуют три основных методологических подхода для проведения данного испытания: гель-тромб метод, основанный на образовании геля; турбидиметрический метод, основанный на помутнении реакционной смеси после расщепления субстрата, содержащегося в ЛАЛ-реактиве; и хромогенный метод, основанный на появлении окрашивания после расщепления синтетического пептид-хромогенного комплекса.

В данной статье описаны следующие шесть тестов, основанных на описанных выше принципах:

– Качественный гель-тромб тест (Метод А);
– Количественный гель-тромб тест (Метод В);
– Турбидиметрический кинетический тест (Метод С);
– Хромогенный кинетический тест (Метод D);
– Хромогенный тест по конечной точке (Метод Е);
– Турбидиметрический тест по конечной точке (Метод F).

Испытание проводят любым из шести приведенных методов. В случае сомнений или разногласий окончательное заключение принимают на основании результатов, полученных при проведении испытания методом А.

Посуда и ее подготовка

Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в ЛАЛ-тесте, не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должна оказывать влияния на ход реакции.

Рекомендуемым режимом депирогенизации является нагревание при температуре 250 °С не менее 30 минут в соответствии с валидированной процедурой.

Стандарты эндотоксина

Содержание бактериальных эндотоксинов выражается в единицах эндотоксина (ЕЭ) Международного стандарта эндотоксина. Одна международная единица (МЕ) эндотоксина соответствует одной ЕЭ.

При проведении анализа может использоваться Контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ), активность которого установлена по Международному стандарту эндотоксина. КСЭ должен быть предназначен для проведения анализа с данной партией ЛАЛ-реактива (или ТАЛ-реактива)[1]. Растворение и хранение КСЭ осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

ЛАЛ-реактив

Необходимо использовать ЛАЛ-реактив, предназначенный для выбранного метода определения бактериальных эндотоксинов.

Чувствительность реактива (l) выражена в единицах эндотоксина [ЕЭ/мл] и соответствует минимальной концентрации Международного стандарта эндотоксина, которая вызывает образование плотного геля при реакции с данным реактивом (Методы А и В), или соответствует точке с минимальным значением на стандартной кривой (Методы С, D, E и F).

Разведение лиофилизированного ЛАЛ-реактива и его хранение осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

Примечание: ЛАЛ-реактив, кроме эндотоксинов, может реагировать и с некоторыми β-гликанами, поэтому возможно использование специфического ЛАЛ-реактива, у которого удален фактор G, реагирующий с гликанами. Также разрешается применение вспомогательных растворов, которые блокируют реакционную систему фактора G. Такие реактивы могут применяться для определения эндотоксинов в присутствии гликанов.

Вода для ЛАЛ-теста

Для приготовления растворов реактивов и разведений испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста. Вода для ЛАЛ-теста должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде для инъекций, и при этом не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте.

Подготовка испытуемого образца

Каждый отобранный образец испытывается индивидуально.

Для растворения и/или разведения испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста, если в фармакопейной статье не указан иной растворитель. Испытуемый раствор должен иметь рН в пределах, указанных производителем ЛАЛ-реактива, обычно 6,0 – 8,0. В случае необходимости рН доводят до нужного значения растворами кислоты, основания или с помощью буферного раствора. Используемые растворы не должны содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должны оказывать влияния на ход реакции.

Максимально допустимое разведение испытуемого лекарственного средства

Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого лекарственного средства, в котором возможно определение концентрации эндотоксина, соответствующей значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов, установленному для данного лекарственного средства.

Испытуемое лекарственное средство может быть проверено в одном разведении или в серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР, которое рассчитывается по формуле:

be-1

где:

«предельное содержание бактериальных эндотоксинов» – допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в фармакопейной статье;

«концентрация испытуемого раствора» – концентрация лекарственного средства или действующего вещества, для которого указано предельное содержание бактериальных эндотоксинов

– чувствительность ЛАЛ-реактива, в ЕЭ/мл.

Для расчета предельного содержания бактериальных эндотоксинов используют следующую формулу:

где:

К – пороговая пирогенная доза, равная 5 ЕЭ/кг в 1 час для испытуемого лекарственного препарата (если он вводится пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального). При интратекальном пути введения лекарственного препарата К составляет 0,2 ЕЭ/кг;

М – максимальная терапевтическая доза испытуемого лекарственного средства, вводимая в течение одного часа (выражается в мг, мл или ЕД на 1 кг массы тела).

Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых внутривенно, предельное содержание бактериальных эндотоксинов рассчитывают как 175/V, где V – максимальная рекомендованная доза в мл. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых интратекально, предельное содержание бактериальных эндотоксинов равняется 14/V.

Для лекарственных препаратов, доза которых рассчитывается на м² поверхности тела (например, противоопухолевые препараты), пороговая пирогенная доза (К) составляет 100 ЕЭ/м².

Гель-тромб тест (Методы А и В)

Гель-тромб метод позволяет установить наличие или измерить количественно концентрацию эндотоксинов в пробе. В результате реакции ЛАЛ-реактива с эндотоксином увеличивается вязкость реакционной смеси вплоть до формирования плотного геля.

Для обеспечения точности и достоверности испытаний заявленную чувствительность ЛАЛ-реактива следует подтвердить, а также провести испытание на наличие мешающих факторов, как описано в разделе «Предварительные анализы».

Процедура испытания

В круглодонные пробирки диаметром 10 мм вносят равные объемы испытуемого раствора и ЛАЛ-реактива (по 0,1 мл). Реакционные смеси аккуратно перемешивают и инкубируют при температуре 37 ± 1 °С в течение 60 ± 2 минут. Во время инкубирования следует избегать вибрации и ударов. По истечении указанного срока визуально регистрируют результаты как положительные или отрицательные. Положительная реакция (+) характеризуется образованием плотного геля, который не разрушается при аккуратном однократном переворачивании пробирки на 180°. Отрицательная реакция (–) характеризуется отсутствием такого геля.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива

Анализ проводят для каждой новой серии используемого ЛАЛ-реактива, а также при изменении условий эксперимента, используемых материалов и реактивов, способных повлиять на результаты теста.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят растворы C и D по схеме, приведенной в Таблице 1.

Таблица 1 – Схема эксперимента «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива»

be-4

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (проверка чувствительности ЛАЛ-реактива);

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Опыт проводят, как описано в разделе «Процедура анализа».

Результаты и интерпретация

Анализ считают достоверным, если:

– для раствора D (отрицательный контроль) во всех повторностях получены отрицательные результаты;
– для раствора С с концентрацией 2l, получены положительные результаты;
– для раствора С с концентрацией 0,25l, получены отрицательные результаты.

Конечной точкой реакции для каждой из повторностей раствора С является положительный результат, полученный для раствора с наименьшей концентрацией КСЭ. По этим результатам рассчитывается среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива по следующей формуле:

где:

– сумма логарифмов концентраций КСЭ в конечной точке реакции в каждой из повторностей;

f – число повторностей.

Заявленная чувствительность ЛАЛ-реактива считается подтвержденной и используется в дальнейших расчетах в том случае, если полученное в эксперименте значение чувствительности ЛАЛ-реактива, не менее 0,5 и не более 2.

Мешающие факторы

Испытуемое лекарственное средство может содержать мешающие факторы, усиливающие и/или ингибирующие реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами. Обнаружить эти явления можно, сравнив способность используемого ЛАЛ-реактива реагировать с раствором КСЭ в воде для ЛАЛ-теста и в растворе испытуемого лекарственного средства в стандартных условиях проведения эксперимента.

Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР. Используемые в данном анализе пробы испытуемого лекарственного средства (или его разведения) не должны содержать бактериальных эндотоксинов в определяемых в тесте количествах.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят растворы А – D по схеме, приведенной в Таблице 2.

Раствор А – испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении (контроль отсутствия бактериальных эндотоксинов);

Растворы В – серия разведений КСЭ в растворе испытуемого лекарственного средства (выявление возможности ингибирования или усиления реакции);

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (положительный контроль);

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Таблица 2 – Схема эксперимента «Мешающие факторы»

Результаты и интерпретация

Результаты эксперимента считаются достоверными, если:Опыт проводят, как описано в разделе «Процедура анализа».

– для растворов А и D получены отрицательные результаты во всех повторностях;

– для растворов С (положительный контроль) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 и не более 2.

По результатам, полученным для каждой из повторностей растворов В, рассчитывают среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива. Расчет проводят, как описано в разделе «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива». Если полученное среднее значение оказалось не менее 0,5l и не более 2l, считают доказанным, что испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении не содержит мешающих факторов, способных ингибировать и/или усиливать реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами и оно может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если обнаружено присутствие мешающих факторов для испытуемого лекарственного средства, которое проверялось в разведении, меньшем МДР, анализ повторяют в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. В большинстве случаев дополнительное разведение испытуемого лекарственного средства способно устранить действие мешающих факторов. Использование ЛАЛ-реактива большей чувствительности позволяет увеличить степень разведения.

Действие мешающих факторов может быть преодолено соответствующей подготовкой образца, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурной обработкой. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен изменять концентрацию бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому к раствору испытуемого лекарственного средства КСЭ известной концентрации добавляют перед проведением такой обработки, после чего проводят анализ «Мешающие факторы». Если после обработки выбранным способом результаты анализа окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если испытуемое лекарственное средство нельзя освободить от мешающих факторов, оно не может быть исследовано на предмет содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод А)

Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят Растворы А – D по схеме, приведенной в Таблице 3.

Раствор А – испытуемое лекарственное средство в разведении, в котором отсутствуют мешающие факторы, или в большем разведении, не превышающем МДР;

Раствор В – испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 (положительный контроль испытуемого образца).

Раствор С – раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста с конечной концентрацией 2 (положительный контроль).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе «Процедура анализа».

Таблица 3 – Схема эксперимента «Качественный анализ»

Результаты и интерпретация

Анализ считают достоверным, если:

– для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях,

– для раствора С (положительный контроль) во всех повторностях получены положительные результаты,

– для раствора В (положительный контроль испытуемого образца) в обеих повторностях получены положительные результаты.

Если для раствора А в двух повторностях получены отрицательные результаты, лекарственное средство считают выдержавшим испытания.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, меньшем МДР, в двух повторностях получены положительные результаты, анализ следует повторить в большем разведении или в разведении, равном МДР.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, равном МДР, в двух повторностях получены положительные результаты, то лекарственное средство не соответствует требованиям раздела «Бактериальные эндотоксины» фармакопейной статьи.

Если положительный результат получен в одной из повторностей для раствора А, то проводят повторный анализ. Лекарственное средство считается выдержавшим испытания, если в повторном анализе для двух повторностей получены отрицательные результаты.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод В)

Этим методом определяют содержание бактериальных эндотоксинов с помощью ряда последовательных разведений испытуемого лекарственного средства.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят Растворы A – D по схеме, приведенной в Таблице 4.

Растворы А – разведения испытуемого лекарственного средства, начиная с того разведения, в котором отсутствуют мешающие факторы, до наибольшего разведения, не превышающего МДР.

Раствор В – наименьшее разведение из серии разведений раствора А, к которому добавлен раствор КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 (положительный контроль испытуемого образца).

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (положительный контроль).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе «Процедура анализа».

Таблица 4 – Схема эксперимента «Количественный анализ»

Результаты и интерпретация

Анализ считают достоверным, если:

– для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в двух повторностях,

– для раствора В (положительный контроль испытуемого образца) получены положительные результаты в двух повторностях,

Для растворов А конечной точкой реакции является положительный результат, полученный для наибольшего разведения испытуемого лекарственного средства.

Значение произведения фактора этого разведения на величину чувствительности ЛАЛ-реактива (l) равно концентрации эндотоксина в растворе А, полученной для данной повторности. Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина рассчитывают, как описано в разделе «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива».

Если во всех повторностях серии растворов А получены отрицательные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве меньше величины произведения чувствительности ЛАЛ-реактива и наименьшего фактора разведения. Если во всех повторностях серии растворов А получены положительные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве больше величины произведения чувствительности ЛАЛ-реактива и наибольшего фактора разведения.

Лекарственное средство считают выдержавшим испытание, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (Методы C, D, E и F) ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (C и F)

Турбидиметрические методы относятся к фотометрическим методам, основанным на измерении степени мутности реакционной смеси. В зависимости от принципа, положенного в основу проведения испытания, указанный метод может быть проведен как турбидиметрический тест по конечной точке, либо как турбидиметрический кинетический анализ.

Турбидиметрический тест по конечной точке (Метод F) основан на измерении степени мутности реакционной смеси в конце инкубационного периода, которая зависит от концентрации эндотоксина.

Турбидиметрический кинетический тест (Метод С) основан на определении скорости развития мутности реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности.

Испытание проводят при температуре инкубирования, рекомендованной производителем ЛАЛ-реактива (обычно 37 ± 1°С).

ХРОМОГЕННЫЕ МЕТОДЫ (D и E)

Хромогенные методы используют для измерения количества хромофора, высвободившегося из хромогенного субстрата в результате реакции эндотоксинов с ЛАЛ-реактивом. В зависимости от принципа, положенного в основу испытания, этот метод может быть проведен как хромогенный тест по конечной точке или как хромогенный кинетический анализ.

Хромогенный тест по конечной точке (Метод Е) основан на измерении интенсивности окраски реакционной смеси, зависящей от количества хромофора, высвободившегося в конце инкубационного периода. Количество, выделившегося хромофора, зависит от концентрации эндотоксина.

В процессе испытания хромогенным кинетическим методом (метод D) определяют скорость развития окраски реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности реакционной смеси.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Для подтверждения достоверности и точности испытания турбидиметрическим или хромогенным методом проводят предварительные анализы, позволяющие убедиться в достоверности критериев для стандартной кривой и в том, что испытуемый раствор не содержит факторов, мешающих проведению реакции.

При внесении любых изменений, способных повлиять на результаты эксперимента, требуется дополнительное подтверждение достоверности и точности испытания.

Проверка достоверности критериев стандартной кривой

Анализ проводят для каждой новой серии ЛАЛ-реактива.

Для построения стандартной кривой из исходного раствора КСЭ готовят не менее трех различных концентраций эндотоксина в соответствии с рекомендациями производителя ЛАЛ-реактива. Анализ проводят, как минимум, в трех повторностях в условиях, предусмотренных производителем ЛАЛ-реактива (объемные соотношения, время инкубирования, температура, рН и т.д.).

Если в кинетических методах необходимо построить стандартную кривую с диапазоном КСЭ, превышающим 2 lg величины концентрации эндотоксина для каждого изменения диапазона измерения на lg величины концентраций эндотоксина, в схему опыта необходимо включить раствор КСЭ соответствующей концентрации.

Для проверяемого диапазона концентраций эндотоксина абсолютное значение коэффициента корреляции |r| должно быть равно или более 0,980.

Мешающие факторы

Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР.

Процедура испытания

Готовят растворы A – D, как указано в Таблице 5. Испытание растворов A, B, C и D проводят по меньшей мере в двух повторностях, в соответствии с рекомендациями производителя ЛАЛ-реактива (объемы и объемные соотношения испытуемого препарата и ЛАЛ-реактива, время инкубирования, температура, рН и т.д.).

Таблица 5 – Схема эксперимента «Мешающие факторы»

be-11

Раствор А — раствор испытуемого лекарственного средства в разведении, не превышающем значение МДР;

Раствор В — испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна соответствовать или быть близкой среднему значению концентраций КСЭ, использованных для построения стандартной кривой (положительный контроль испытуемого образца);

Растворы С — растворы КСЭ, используемые для построения стандартной кривой в тех же концентрациях, которые использовались при проведении анализа «Проверка достоверности критериев стандартной кривой» (положительный контроль);

Раствор D — вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Испытание считают достоверным, если соблюдены следующие условия:

– результаты, полученные для стандартной кривой (Раствор С) соответствуют требованиям достоверности, установленным в разделе «Проверка достоверности критериев для стандартной кривой»;

– результат, полученный для раствора D (отрицательный контроль) не превышает значения величины, указанной в инструкции к используемому ЛАЛ-реактиву или менее концентрации эндотоксина, определяемой используемым методом.

Полученное в опыте среднее значение концентрации добавленного эндотоксина рассчитывают, вычитая из среднего значения концентрации эндотоксина в растворе В (содержащего добавленный эндотоксин) среднее значение концентрации эндотоксина в растворе А (при его наличии).

Считают доказанным, что испытуемый раствор не содержит мешающих факторов, если в условиях испытания измеренная концентрация эндотоксина, добавленного в испытуемый раствор, составляет 50-200% от известной концентрации добавленного эндотоксина.

Если определенная в опыте концентрация эндотоксина не укладывается в заданные рамки, делают заключение, что испытуемый препарат содержит факторы, мешающие реакции. В этом случае опыт может быть повторен в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. Помимо большего разведения испытуемого препарата, влияние мешающих факторов может быть преодолено соответствующей обработкой, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурным воздействием. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен приводить к уменьшению концентрации бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому перед проведением такой обработки к испытуемому раствору следует сначала добавить раствор КСЭ известной концентрации, после чего повторить анализ «Мешающие факторы». Если после обработки выбранным способом результаты анализа окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Проведение испытания

Процедура испытания

Испытание проводят в соответствии с методикой, приведенной в разделе «Мешающие факторы».

Результаты

Для раствора А в каждой повторности определяют концентрацию эндотоксинов, используя стандартную кривую, полученную на основании серий разведений КСЭ (Раствор С).

Испытание считают достоверным, если соблюдены следующие условия:

результаты, полученные для стандартной кривой (Растворы С), соответствуют требованиям достоверности, установленным в разделе «Проверка достоверности критериев для стандартной кривой»;
определенная в опыте концентрация эндотоксина, добавленного к раствору B после вычитания значения концентрации эндотоксина, определённого в растворе А, находится в пределах от 50 до 200% от известной величины;
результат, полученный для раствора D (отрицательный контроль), не превышает значения величины, указанной в инструкции к используемому ЛАЛ-реактиву или менее концентрации эндотоксина, определяемой используемым методом.

Интерпретация результатов

Лекарственное средство считают выдержавшим испытание, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов в повторностях раствора А (с учетом разведения и концентрации испытуемого лекарственного средства) менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.

[1] Примечание: Контрольный стандарт эндотоксина и ЛАЛ-реактив или ТАЛ-реактив должны быть зарегистрированы в МЗ РФ.

Скачать в PDF ОФС.1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины

GPM.1.2.4.0006.15 Bacterial endotoxins

Ministry of Health of the Russian Federation

General Pharmacopoeia Monograph

Bacterial endotoxins GPM.1.2.4.0006.15
Replaces the State Pharmacopoeia of the Russian Federation XII, Part 1 Monograph, GPM 42-0062-07

The present General Pharmacopoeia Monograph describes the methods used to detect bacterial endotoxins in medicinal products designed for parenteral administration and drug substances used to manufacture such products.

The bacterial endotoxins assay is carried out using a reagent, which presents a lysate of blood cells (amoebocytes) from horseshoe crab: Limulus polyphemus (LAL-reagent) or Tachypleus tridentatus (TAL-reagent). LAL reagents interact specifically with bacterial endotoxins. As a result of an enzymatic reaction, the reactant mixture undergoes a change proportionate to the concentration of the endotoxin.

There are three major methodological approaches to performing this test: the gel clot assay based on gel formation; the turbidimetric principle in which the reactant mixture becomes turbid after degradation of the substrate contained in the LAL reagent; and the chromogenic principle based on the colour induced by degradation of a synthetic peptide – chromogenic complex.

The present Pharmacopoeia Monograph describes the following six tests based on the aforementioned principles:

– Qualitative gel clot assay (Method А);

– Quantitative gel clot assay (Method В);

– Turbidimetric kinetic test (Method С);

– Chromogenic kinetic test (Method D);

– Chromogenic endpoint assay (Method Е);

– Turbidimetric endpoint assay (Method F).

The test may be performed using any of the six aforementioned methods. In case of any doubts or discrepancies, the final conclusion should be made on the basis of results obtained using Method A.

Laboratory utensils and their preparation

Glass and plastic laboratory ware used in the LAL-test should not contain bacterial endotoxins in quantities detected in this test, and should not affect the course of the reaction.

The recommended depyrogenation regimen is heating at temperature 250 °C over at least 30 minutes in accordance with the validated procedure.

Endotoxin standards

Content of bacterial endotoxins is expressed in Endotoxin Units (EU) of the International Endotoxin Standard. One endotoxin International Unit (IU) corresponds to one EU.

Analysis may also be based on the Endotoxin Reference Standard (ERS); its activity is established according to the International Standard for endotoxins. An Endotoxin Reference Standard should be designed for testing a particular LAL-reagent (TAL-reagent) lot[1]. Dissolution and storage of the ERS are carried out according to the manufacturer’s Instructions for Use.

LAL reagent

The LAL-reagent designed for the selected bacterial endotoxins testing method should be used.

LAL-reagent sensitivity (λ) is expressed in endotoxin units [EU/mL], and corresponds to the minimum International Endotoxin Standard concentration that promotes the formation of a dense gel when reacting with the particular LAL-reagent (Methods А and В) or corresponds to the minimum value point on the standard curve (Methods С, D, E, and F).

Dissolution of the lyophilized LAL-reagent and its storage are carried out in accordance with the manufacturer’s Instructions for Use.

Note: Apart from endotoxins, a LAL reagent may also react with some β-glycans, and therefore a specific LAL reagent deprived of the G-factor, which reacts with glycans, may be employed. Use of accessorial solutions that block the G factor reacting system is allowed as well. These reagents may be used for the determination of endotoxins in the presence of glycans.

Water for LAL testing

Water for LAL-testing is used for preparation of all reagents and dilutions of the tested medicinal product. Water for LAL-testing should comply with the requirements established for Water for Injections, and it should not contain bacterial endotoxins in quantities detectable by the test.

Preparation of the tested sample

Every selected sample should be tested individually.

Water for LAL-testing is used to dissolve and / or dilute the tested medicinal product, unless otherwise specified in the Pharmacopoeia Monograph. The tested solution should have its pH value within the range specified by the manufacturer of the LAL-reagent, most commonly 6.0 – 8.0. When necessary, the pH value of the tested solution is adjusted using acidic or basic solutions, or a buffer solution. The employed solutions should not contain bacterial endotoxins in quantities detectable by the test, and should not affect the course of the reaction.

Maximum acceptable dilution of the tested medicinal product

The maximum acceptable dilution (MAD) is the highest dilution of the tested medicinal product in which the endotoxin concentration corresponding to the maximum content of bacterial endotoxins approved for the particular medicinal product can be detected.

The tested medicinal product can be tested either in one dilution or in a series of dilutions, provided that the final dilution does not exceed the MAD value, which is calculated according to the following equation:

MAD

maximum content of bacterial endotoxins

∙

concentration of the tested solution

where: “maximum content of bacterial endotoxins” is the admissible content of bacterial endotoxins in the tested medicinal product, as specified in the Pharmacopoeia Monograph;

“concentration of the tested solution” is the concentration of the medicinal product or active ingredient for which the maximum content of bacterial endotoxins is established;

λ is the sensitivity of the LAL reagent (EU/mL).

The following equation is used to calculate the maximum content of bacterial endotoxins:

= ,

where: K – is the threshold pyrogenic dose equal to 5 EU/kg per hour for the tested medicinal product (if the latter is administered to patients through any parenteral route, except for the intrathecal route). If the drug is administered through the intrathecal route, the K value is 0.2 EU/kg;

М – maximum therapeutic dose of the tested medicinal product administered over a period of one hour (expressed in mg, mL, or units per kg of body weight).

For radiopharmaceutical medicinal products administered intravenously, the maximum content of bacterial endotoxins is calculated as 175 / V, where V is the maximum recommended dose (mL). For radiopharmaceutical medicinal products administered intrathecally, the maximum content of bacterial endotoxins is calculated as 14 / V.

If doses of the medicinal product are expressed per square metre of body surface area (such as antineoplastic drugs), the threshold pyrogenic dose (K) is set at 100 EU/m².

Gel clot assay (Methods А and В)

The gel clot method permits detection or quantification of endotoxins in a sample. The reaction between the LAL reagent and the endotoxin results in an increase in the viscidity of the reaction mixture until a dense gel is formed.

To ensure accuracy and reliability of test results, the claimed sensitivity of the LAL reagent should be verified, and a test for the presence of interfering factors should be performed as described in the “Preparatory testing” section.

Procedure description. Transfer equal volumes of the tested solution and the LAL-reagent (0.1 mL of each) into round-bottomed test tubes with a diameter of 10 mm. Mix carefully the reaction mixtures, and incubate at temperature 37 ± 1 °C over 60 ± 2 minutes. During incubation, vibration and mechanical shocks should be avoided. After the specified period of time, results are assessed by visual examination as positive or negative. A positive reaction (+) is characterized by the formation of a dense gel, which is not destroyed by a single careful 180° turn of the test tube. A negative reaction (-) is characterized by the absence of such gel.

PREPARATORY TESTING

Confirmation of the claimed LAL-reagent sensitivity

This analysis is carried out for each new batch of the used LAL-reagent, as well as upon any changes in the experimental conditions, used materials and reagents that could have an effect on test results.

Procedure description. For this test, solutions C and D are prepared in accordance with the requirements of Table 1.

Table 1 – Experiment design, “Confirmation of the claimed LAL-reagent sensitivity”

Solution

Original solution

Diluent

Dilution factor

Final ERS concentration in the tested solution

Number of replicates

С

ERS solution in Water for LAL-testing with the 2λ ERS concentration

Water for LAL-testing

2λ

1λ

0,5 λ

0,25 λ

Water for LAL-testing

─

The Solutions C series consists of ERS dilutions in Water for LAL-testing (LAL-reagent sensitivity verification);

Solution D – Water for LAL-testing (negative control).

The test is carried out as described in the “Procedure description” section.

Results and interpretation An analysis is considered valid if the following conditions are fulfilled:

– for Solution D (negative control) – negative results are obtained in all test replicates;

– for Solution C with the 2λ concentration – positive results are obtained;

– for Solution C with the 0.25λ concentration – negative results are obtained.

The reaction end-point for each replicate of the Solutions C series is a positive result obtained for the solution with the lowest ERS concentration. These results are used to calculate the geometric mean value of LAL-reagent sensitivity; the calculation is performed according to the following equation:

Geometric mean of ERS concentrations at reaction end-point

antilog ( ),

where: e is the sum of logarithms of the ERS concentrations at reaction end-points in each of the replicates;

f is the number of replicates.

The claimed LAL-reagent sensitivity is considered validated and can be used in subsequent calculation, provided that the LAL-reagent sensitivity value obtained in the test is not below 0.5λ and does not exceed 2λ.

Interfering factors

The tested medicinal product may contain interfering factors intensifying and / or inhibiting the reaction of the LAL-reagent with the bacterial endotoxins. These events may be recognized through comparison of the ability of the used LAL-reagent to react with the ERS solution in Water for LAL-testing and in the solution of the tested medicinal product under the standard experimental conditions.

A medicinal product may be tested in any dilution not exceeding the MAD value. The samples of the tested medicinal product (or its dilution) used in this analysis should not contain bacterial endotoxins in quantities detectable by the test.

Procedure description. For this analysis, Solutions A – D are prepared according to the requirements included in Table 2.

Solution A – the tested medicinal product in the selected dilution (control for the absence of bacterial endotoxins).

Solutions B – the series of ERS dilutions in the solution of the tested medicinal product (test detecting the possibility of reaction inhibition or intensification).

Solutions C – the series of ERS dilutions in Water for LAL-testing (positive control).

Solution D – Water for LAL-testing (negative control).

Table 2 – Experiment design, “Interfering factors”

Solution	Original solution	Diluent	Dilution factor	Final endotoxin concentration in the tested solution	Number of replicates
A	Tested medicinal product	–	─	─	4
B	Tested medicinal product containing ERS at the 2λ concentration	Tested medicinal product	1 2 4 8	2 λ 1 λ 0.5 λ 025 λ	4 4 4 4
С	ERS solution in Water for LAL-testing with the 2λ ERS concentration	Water for LAL-testing	1 2 4 8	2 λ 1 λ 0.5 λ 025 λ	2 2 2 2
D	Water for LAL-testing	–	─	─	2

This test should be carried out as described in the “Procedure description” section.

Results and interpretation. A test may be considered reliable if the following conditions are fulfilled:

for Solutions A and D – negative results are obtained in all replicates;
for Solutions C (positive control) – the geometric mean value of the bacterial endotoxins concentration should be not less than 0.5λ and not more than 2λ.

Results obtained in each replicate of the Solutions B series are employed to calculate the geometric mean value of LAL-reagent sensitivity. The calculation is carried out as described in the “Confirmation of the claimed LAL-reagent sensitivity” section. If the obtained mean sensitivity value is not less than 0.5λ and not more than 2λ, this means that the tested medicinal product in the particular dilution does not contain any interfering factors capable of inhibition and / or intensification of the reaction of the LAL-reagent with bacterial endotoxins, and it therefore may be analyzed for bacterial endotoxins content.

If a presence of interfering factors has been demonstrated for the tested medicinal product analyzed in a dilution lower than the MAD, the test should be repeated for a higher dilution, up to the dilution equal to the MAD. In most cases, additional dilution of the tested medicinal product is capable of eliminating the effects of interfering factors. The use of a LAL-reagent with a higher sensitivity will allow to increase the degree of dilution.

The effects of interfering factors can be overcome with appropriate sample preparation, such as filtration, neutralization, dialysis, or temperature processing. The method selected to remove interfering factors should not change the concentration of bacterial endotoxins in the tested medicinal product, and therefore the ERS with the known concentration is added to the solution of the tested medicinal product before such processing, while the Interfering Factors analysis is carried out afterwards. If the selected method of processing is associated with satisfactory results of the Interfering Factors test, the tested medicinal product may be analyzed for bacterial endotoxins content.

If the interfering factors cannot be removed from the tested medicinal product, the latter cannot be tested for bacterial endotoxins content using the LAL-test.

QUALITATIVE ANALYSIS (Method А)

The objective of this analysis is to demonstrate that the content of bacterial endotoxins in the tested medicinal product sample does not exceed the Maximum Content of Bacterial Endotoxins specified in the Pharmacopoeia Monograph.

Procedure description. For this analysis, Solutions A – D should be prepared according to the requirements presented in Table 3.

Solution A – the tested medicinal product in the dilution containing no interfering factors, or in a higher dilution, provided that it does not exceed the MAD value.

Solution B – the tested medicinal product in the selected dilution, with the Endotoxin Reference Standard added. The final endotoxin concentration in the analyzed solution should be 2λ (positive control of the tested medicinal product).

Solution C – the ERS solution in Water for LAL-testing with final concentration 2λ (positive control).

Solution D – Water for LAL-testing (negative control).

This analysis is carried out as described in the “Procedure description” section.

Table 3 – Experiment design, “Qualitative analysis”

Solution	Baseline solution	Final endotoxin concentration (ERS) in the tested solution	Number of replicates
А	Tested medicinal product	─	2
В	Tested medicinal product containing ERS at the 2λ concentration	2 λ	2
С	ERS solution in Water for LAL-testing with the 2λ ERS concentration	2 λ	2
D	Water for LAL-testing	─	2

Results and interpretation. A test should be considered reliable if the following conditions are fulfilled:

for Solution D (negative control) – negative results are obtained in both replicates;
for Solution C (positive control) – positive results are obtained in all replicates;
for Solution B (positive control of the tested sample) – positive results are obtained in both replicates.

If negative results are obtained for Solution A in both replicates, the medicinal product complies with the requirements of the test.

If a positive result is obtained for both replicates for the tested medicinal product’s dilution less than the MAD, the test should be repeated for a higher dilution or the dilution equal to the MAD.

If a positive result is obtained for both replicates for the tested medicinal product’s dilution equal to the MAD, such medicinal product does not comply with the requirements of the Bacterial Endotoxins Section of the Pharmacopoeia Monograph.

If a positive result is obtained for one of the replicates for Solution A, a repeat test should be carried out. If negative results are obtained for both replicates in the second test, such medicinal product has passed the test.

QUANTITATIVE ANALYSIS (Method В)

This method serves to determine the content of bacterial endotoxins using a series of successive dilutions of the tested medicinal product.

Procedure description. For this analysis, Solutions A – D should be prepared according to the requirements presented in Table 4.

Solutions A – the dilutions of the tested medicinal product, beginning from the dilution containing no interfering factors to the highest dilution not exceeding the MAD value.

Solution B – the lowest dilution of the Solution A serial dilutions to which the ERS solution was added. The final endotoxin concentration in the analyzed solution should be 2λ (positive control of the tested sample).

Solutions C – the series of ERS dilutions in Water for LAL-testing (positive control).

Solution D – Water for LAL-testing (negative control).

This analysis is carried out as described in the “Procedure description” section.

Table 4 – Experiment design, “Quantitative analysis”

Solution	Original solution	Diluent	Dilution factor	Final ERS concentration in the tested solution	Number of replicates
А	Tested medicinal product	Water for LAL-testing	1 2 4 8 and so forth to MAD	─ ─ ─ ─	2 2 2 2
В	Tested medicinal product containing ERS at the 2λ concentration	Tested medicinal product	1	2 λ	2
С	ERS solution in Water for LAL-testing with the 2λ ERS concentration	Water for LAL-testing	1 2 4 8	2 λ 1 λ 0.5 λ 0.25 λ	2 2 2 2
D	Water for LAL-testing	–	–	─	2

Results and interpretation. A test should be considered reliable if the following conditions are fulfilled:

for Solution D (negative control) – negative results are obtained in both replicates;
for the Solutions C series (positive control) – the geometric mean value of the bacterial endotoxins concentration should be not less than 0.5λ and not more than 2λ;
for Solution B (positive control of the tested sample) – positive results are obtained in two replicates;
for the Solutions A series – the reaction end-point is a positive result obtained for the highest dilution of the tested medicinal product.

The respective dilution factor multiplied by the LAL-reagent sensitivity value (λ) is equal to the endotoxin concentration in Solution A obtained for this particular replicate.

The geometric mean value of the endotoxin concentration is calculated as described in the “Confirmation of the claimed LAL-reagent sensitivity” section.

If negative results are obtained for all replicates of the Solutions A series, the bacterial endotoxins concentration in the tested medicinal product is below the LAL-reagent sensitivity value multiplied by the lowest dilution factor. If positive results are obtained for all replicates of the Solutions A series, the bacterial endotoxins concentration in the tested medicinal product is above the LAL-reagent sensitivity value multiplied by the highest dilution factor.

A medicinal product has passed the test if the mean bacterial endotoxins content value produced by the test is below the Maximum Content of Bacterial Endotoxins value specified in the Pharmacopoeia Monograph.

PHOTOMETRIC METHODS (Methods C, D, E, and F)

TURBIDIMETRIC METHODS (C and F)

Turbidimetric methods are a variant of photometric methods based on measurement of the turbidity of the reaction mixture. Depending on the principle underlying the test, this method may be conducted either as an endpoint turbidimetric test or a kinetic turbidimetric assay.

The endpoint turbidimetric test (Method F) is based on measurement of the turbidity of the reaction mixture at the end of the incubation period, which depends on the endotoxin concentration.

The kinetic turbidimetric assay (Method С) is based on determination of the turbidity development rate of the reaction mixture evaluated by the time required to achieve a target optical density value.

This test is conducted at the incubation temperature recommended by the manufacturer of the LAL reagent (usually 37 ± 1 °С).

CHROMOGENIC METHODS (D and E)

Chromogenic methods are used to determine the amount of the chromophore released from a chromogenic substrate as a result of the reaction between endotoxins and the LAL reagent. Depending on the principle underlying the test, this method may be conducted either as an endpoint chromogenic test or a kinetic chromogenic assay.

The endpoint chromogenic test (Method E) is based on measurement of the colour intensity of the reaction mixture, which depends on the amount of the chromophore released at the end of the incubation period. The amount of the released chromophore depends on the endotoxin concentration.

During the kinetic chromogenic assay (Method D), the rate at which the colour of the reaction mixture develops is determined; it is evaluated by the time required to achieve a target reaction mixture optical density value.

This test is conducted at the incubation temperature recommended by the manufacturer of the LAL reagent (usually 37 ± 1 °С).

PREPARATORY TESTING

To demonstrate the accuracy and reliability of test results obtained with the turbidimetric or chromogenic method, preliminary tests should be carried out to make sure that the standard curve criteria are reliable and that the tested solution contains no factors interfering with the course of the reaction.

Any changes that can have an effect on results of this experiment require additional confirmation of the reliability and accuracy of this test.

Standard curve criteria reliability check

This analysis should be carried out for each new LAL reagent batch.

To obtain a standard curve, not less than three different concentrations of the endotoxin should be prepared from the stock ERS solution in accordance with the recommendations of the LAL reagent’s manufacturer. The test should be performed with at least replicates, under the conditions recommended by the manufacturer of the LAL reagent (volume ratios, incubation time, temperature, pH value, etc.).

If the procedure of a kinetic method necessitates a standard curve with an ERS range exceeding 2 lg of the endotoxin concentration value for each measurement range change of an endotoxin concentration value lg, an ERS solution of the appropriate concentration should be included in the design of this experiment.

The absolute correlation coefficient |r| value for the examined endotoxin concentration range should be equal to or more than 0.980.

Interfering factors

The test may be performed on any medicinal product in any dilution not exceeding the MAD value.

Procedure description. Solutions A – D should be prepared as specified in Table 5. Solutions A, B, C, and D should be tested on at least two replicates, in accordance with the recommendations of the LAL reagent’s manufacturer (volumes and volume ratios of the tested medicinal product and the LAL reagent, incubation time, temperature, pH value, etc.).

Table 5 – Experiment design, “Interfering factors”

Solution	Endotoxin concentration	Solution mixed with endotoxin	Number of replicates
А	─	Tested solution	Not less than 2
B	Mean standard curve concentration	Tested solution	Not less than 2
C	Not less than 3 concentrations (the lowest concentration is denominated λ)	Water for LAL testing	Not less than 2 for each of the concentrations
D	─	Water for LAL testing	Not less than 2

Solution А — the solution of the tested medicinal product in a dilution not exceeding the MAD value;

Solution В — the tested medicinal product in the selected dilution upon addition of the ERS. The final endotoxin concentration of the analyzed solution should be equal or close to the mean value for the ERS concentrations used to plot the standard curve (positive control of the tested sample);

Solutions С — the ERS solutions used to plot the standard curve, at the same concentrations that were used during the «Standard curve criteria reliability check» (positive control);

Solution D — Water for LAL testing (negative control).

Test results are considered reliable if the following conditions are fulfilled:

– results obtained for the standard curve (Solution С) meet the reliability criteria established for the «Standard curve criteria reliability check» section;

– the result obtained for Solution D (negative control) does not exceed the value specified in the Instructions for Use of the LAL reagent used or is lower than the endotoxin concentration detected by the method used.

The experimental mean concentration of the added endotoxin is calculated by subtracting the mean endotoxin concentration of Solution А (if available) from the mean endotoxin concentration of Solution В (containing the added endotoxin).

The tested solution is considered to be demonstrated to contain no interfering factors if the measured concentration of the endotoxin added to the tested solution is 50 % to 200 % of the known concentration of the added endotoxin under the test conditions.

If the endotoxin concentration determined in the experiment lies outside of the established limits, a conclusion is made that the tested medicinal product contains factors interfering with the reaction. In this case, the test may be repeated at a higher dilution, up to the dilution equal to the MAD. Apart from higher dilutions of the tested medicinal product, the effects of interfering factors may be overcome by appropriate processing, such as filtration, neutralization, dialysis, or temperature processing. The method chosen to eliminate interfering factors should not decrease the concentration of bacterial endotoxins in the tested medicinal product, therefore the ERS solution of the known concentration should first be added to the tested solution before such processing, and afterwards the «Interfering factors» analysis should be repeated. If test results obtained after the selected type of processing are deemed satisfactory, the tested medicinal product may be analyzed for the content of bacterial endotoxins.

Test procedure

Procedure description. The test should be carried out in accordance with the procedure description included in the «Interfering factors» section.

Results. The endotoxin concentration should be determined for each replicate of Solution А using the standard curve obtained using the ERS serial dilutions (Solution С).

Test results are considered reliable if the following conditions are fulfilled:

results obtained for the standard curve (Solutions С) meet the reliability criteria established for the «Standard curve criteria reliability check» section;
the experimental concentration of the endotoxin added to Solution B after subtracting the endotoxin concentration value found for Solution А lies in the range of 50 % to 200 % of the known value;
the result obtained for Solution D (negative control) does not exceed the value specified in the Instructions for Use of the LAL reagent used or is lower than the endotoxin concentration detected by the method used.

Interpretation of results. A medicinal product passes the test if the experimental mean content of bacterial endotoxins found for the Solution А replicates (adjusted for the dilution and concentration of the tested medicinal product) is lower than the bacterial endotoxins content upper limit specified in the Pharmacopoeia Monograph.

[1] The Endotoxin Reference Standard (ERS) and LAL-reagent or TAL-reagent should be authorized for use by the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation.

Download in PDF GPM.1.2.4.0006.15 Bacterial endotoxines