Содержание

Глава 2. Оценка вирусной безопасности биологических (биотехнологических) лекарственных средств, полученных из клеточных линий человеческого и животного происхождения

Введение

В настоящей главе описаны испытания и оценка вирусной безопасности биологических (биотехнологических) лекарственных средств, полученных из охарактеризованных клеточных линий человеческого или животного происхождения (млекопитающих, птиц и насекомых), а также описаны данные, которые необходимо представлять в составе регистрационного досье, подаваемого в уполномоченные органы государств-членов при регистрации биологического лекарственного препарата. В настоящей главе в рамках понятия «вирус» не рассматриваются такие нетрадиционные трансмиссивные агенты, как возбудители губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота и скрейпи овец и коз.

Положения настоящей главы относятся к лекарственным средствам, полученным с применением клеточных культур из охарактеризованных банков клеток. К ним относятся лекарственные препараты, полученные с применением клеточных культур in vitro, например, интерфероны, моноклональные антитела и препараты, полученные по технологии рекомбинантной ДНК, включая рекомбинантные субъединичные вакцины. К ним относятся также препараты, полученные при помощи гибридомной технологии in vivo из асцитической жидкости. К последнему случаю предъявляются особые требования, требования по проведению тестирования клеток из охарактеризованных банков, которые были впоследствии выращены in vivo, представлена в приложении № 1 к настоящей главе.

Положения настоящей главы применимы также к прочим биологическим средствам, частные требования к которым включают в себя ссылку на настоящую главу. Настоящая глава не распространяется на инактивированные вакцины, все живые вакцины, в том числе полученные методами генной инженерии.

Риск вирусной контаминации является особенностью всех биотехнологических препаратов, получаемых из клеточных линий. Такая контаминация может быть результатом контаминации исходных клеточных линий (субстратов клеток) или случайной контаминации вирусом в течение процесса производства и может иметь серьезные клинические последствия. Предполагается, что безопасность данных препаратов в отношении вирусной контаминации может быть в разумной степени обеспечена применением программы тестирования на наличие вируса, а также оценкой эффективности удаления (элиминации) и инактивации вируса в процессе производства в соответствии с рекомендациями, изложенными ниже.

Разработано 3 основных взаимодополняющих подхода к контролю потенциальной вирусной контаминации биотехнологических продуктов:

отбор и испытание клеточных линий и другого сырья, включая компоненты среды, на отсутствие контаминации вирусами, которые могут быть инфекционными и (или) патогенными для человека;
оценка возможностей процесса производства по очистке от инфекционных вирусов;
испытания продукта на соответствующих этапах процесса производства на отсутствие контаминации инфекционными вирусами.

Всем испытаниям присуще характерное для всех количественных методик определения вирусов ограничение: способность обнаруживать низкое содержание вирусов зависит (со статистической точки зрения) от размера выборки. В связи с этим ни один метод как таковой не позволяет установить безопасность препарата. Достоверность отсутствия вирусов в готовом препарате во многих случаях основана не только на прямых методах определения их наличия, но также на подтверждении того, что процесс очистки способен элиминировать и (или) инактивировать вирусы.

Необходимые виды и объем испытаний на вирусы и исследований очистки от вирусов на различных стадиях производства зависит от различных факторов, которые необходимо учитывать на каждой стадии в индивидуальном порядке. К факторам, которые необходимо принимать во внимание, относятся степень характеристики и квалификации банка клеток, природа обнаруженных вирусов, состав питательных сред, методы культивирования, конструкции производственной площадки и оборудования, результаты испытаний на вирусы после культивирования клеток, способность процесса обеспечивать элиминацию вирусов, а также вид препарата и его предполагаемое клиническое применение.

Цель настоящей главы состоит в описании общих подходов к испытанию продукта на наличие (отсутствие) вируса, экспериментов по оценке эффективности очистки от вирусов, рекомендованного подхода к планированию испытаний на наличие вирусов и исследований по очистке от вирусов.

Производители должны использовать указания настоящей главы с учетом особенностей производимого препарата и применяемого процесса производства. Необходимо объяснить и обосновать подход, использованный производителями для построения стратегии обеспечения вирусной безопасности. В дополнение к представлению подробных данных в целях ускорения экспертизы уполномоченным органом государства-члена следует представить резюме по оценке вирусной безопасности. В такое резюме необходимо включить краткое описание всех аспектов исследований вирусной безопасности и стратегий, использованных для предотвращения контаминации вирусами, указанных в настоящей главе.

Потенциальные источники вирусной контаминации

Вирусная контаминация биотехнологических препаратов может происходить от первичного источника клеточных линий или при случайном привнесении вируса во время процесса производства.

2.A. Вирусы, которые могут обнаруживаться в ГБК

Клетки могут иметь латентную или персистирующую вирусную инфекцию (например, герпетическую) или быть заражены эндогенным ретровирусом, который может передаваться вертикально от одного поколения клеток к другому, поскольку вирусный геном встроен в клеточный. Такие вирусы могут экспрессироваться конститутивно или их экспрессия может проявиться спонтанно.

Вирусы могут попасть в ГБК следующими путями:

при получении клеточных линий от инфицированных животных;
при использовании вируса для создания клеточной линии;
при использовании таких контаминированных биологических реагентов, как компоненты сыворотки животных;
при контаминации во время работы с клетками.

2.B. Посторонние вирусы, которые могут быть привнесены во время процесса производства

Вирусы могут быть занесены в лекарственный препарат разными путями, в том числе:

при использовании таких контаминированных биологических реагентов, как компоненты сыворотки животных;
при применении вируса для стимуляции экспрессии генов, кодирующих необходимый белок;
при использовании контаминированного материала, например, колонки для аффинной хроматографии моноклональных антител;
при использовании контаминированного вспомогательного вещества во время получения лекарственной формы;
при контаминации в процессе производства, а также во время работы с клетками и культуральными средами. Мониторинг параметров клеточной культуры может способствовать раннему выявлению потенциальной контаминации посторонними вирусами.

Квалификация (аттестация) клеточной линии: испытание на наличие вирусов

Важной частью характеристики клеточной линии для использования ее в производстве биотехнологичного препарата является надлежащее испытание на наличие вирусов.

3.A. Рекомендуемые испытания на наличие вирусов для ГБК, РБК и клеток предельного для производства клеточного возраста in vitro

Примеры испытаний на наличие вирусов, которые необходимо проводить однократно для клеток разных уровней, включая ГБК, РБК и клетки предельного для производства клеточного возраста in vitro приведены в таблице 1.

Таблица 1

Примеры испытаний на наличие вирусов, которые необходимо проводить однократно для клеток разных уровней

Испытания	ГБК	РБК^[1]	Клетки с предельным возрастом in vitro^[2]
Испытания на наличие ретровирусов и других эндогенных вирусов
Инфицирующая способность	+	–	+
Электронная микроскопия^[3]	+³	–	+³
Обратная транскриптаза^[4]	+⁴	–	+⁴
Прочие вирус-специфичные тесты^[5]^[6]	если применимо⁵	–	если применимо⁵
Испытания на наличие неэндогенных или посторонних вирусов
Испытания in vitro	+	6	+
Испытания in vivo	+	6	+
Испытания выработки 7 антител	+^[7]	–	–
Прочие вирус-специфичные тесты⁸	+^[8]	–	–

[1] В соответствии с разделом 3.A.2 настоящей главы.[2] Клетки с предельным возрастом in vitro: клетки с предельным для производства клеточным возрастом in vitro (в соответствии с разделом 3.A.3 настоящей главы).[3] Позволяет также выявить и другие агенты.[4] Не является необходимым при обнаружении инфицирующей способности ретровируса.[5] Используется для клеточных линий, о которых известно, что они были инфицированы такими агентами.[6] Для первого РБК данное испытаний должно проводиться на клетках с предельным клеточным возрастом in vitro, полученных из этого РБК, для последующих РБК один тест in vitro и in vivo нужно проводить либо непосредственно на РБК, либо на клетках с предельным клеточным возрастом in vitro.[7] Испытания продукции мышиных (MAP), крысиных (RAP), хомячьих (HAP) антител, которые обычно применяются для клеточных линий грызунов.

[8] Испытания для клеточных линий, полученных от человека или нечеловекообразных приматов, или других клеточных линий в зависимости от обстоятельств.

3.А.1. Главный банк клеток

На клетках ГБК нужно проводить интенсивные исследования по выявлению эндогенной и неэндогенной вирусной контаминации. В отношении гетерогибридных клеточных линий, в которых один или более партнеров являются человекообразными или нечеловекообразными обезьянами, необходимо провести испытания на вирусы человекообразных и нечеловекообразных обезьян, поскольку вирусная контаминация таких клеток может представлять собой особую опасность.

Выявление неэндогенных вирусов должно включать инокуляционные испытания in vitro и in vivo и любые другие специальные методы, в том числе такие видоспецифичные тесты, как тест продукции мышиных антител (MAP – mouse antibodies production), которые подходят для определения возможных контаминирующих вирусов с учетом истории пассажей клеточной линии.

3.А.2. Рабочий банк клеток

Каждый РБК как исходный клеточный субстрат для производства биотехнологического продукта необходимо проверить на наличие посторонних вирусов либо непосредственно, либо путем проведения анализа клеток предельного для производства клеточного возраста in vitro, полученных из РБК. Если проводились испытания на наличие неэндогенных вирусов в РБК, а клетки, культивируемые до предельного для производства клеточного возраста in vitro или дольше, полученные из ГБК, были испытаны на наличие посторонних вирусов, сходные испытания на первоначальном РБК проводить не обязательно. Тесты образования антител на РБК обычно не проводят. Приемлем также альтернативный подход, в соответствии с которым полный набор исследований проводят в отношении РБК, а не ГБК.

3.А.3. Клетки предельного для производства клеточного возраста in vitro

Предельный для производства клеточный возраст in vitro определяется на основании данных, полученных на клетках- продуцентах, выращенных в условиях опытно-промышленного или промышленного производства до предполагаемого предельного клеточного возраста in vitro или более. Клетки-продуценты получаются путем экспансии РБК, для их получения допускается также использовать ГБК. Клетки предельного клеточного возраста in vitro необходимо однократно проверить на наличие эндогенных вирусов, которые могли быть не выявлены в ГБК и РБК. По крайней мере, однократное испытание (in vitro и in vivo) клеток предельного для производства клеточного возраста in vitro позволяет убедиться в том, что процесс производства не подвержен контаминации посторонними вирусами. Если на этом этапе выявляются посторонние вирусы, процесс необходимо подвергнуть тщательной проверке для определения причины контаминации и при необходимости полностью реорганизовать его.

3.B. Рекомендуемые испытания для выявления и идентификации вирусов

Для выявления эндогенных и посторонних вирусов могут использоваться разные методы количественного определения.

В таблице 2 приведены примеры таких испытаний, в том числе все рекомендованные для использования протоколы количественного определения, однако этот перечень не является исчерпывающим или строго заданным.

Испытания	Исследуемый материал	Способность к обнаружению	Ограничения к обнаружению
Образование антител	лизат клеток и их культуральная среда	специфичные вирусные антигены	антигены, не инфекционные для животной тест-системы
Скрининг вируса in vivo	лизат клеток и их культуральная среда	широкий спектр вирусов, патогенных для человека	возбудители, которые не реплицируются или не вызывают заболеваний в тест- системах
Скрининг вируса in vitro для: 1) характеристики Банка клеток	лизат клеток и их культуральная среда (при совместном культивировании исследуемый материал должен содержать интактные клетки)	широкий спектр вирусов, патогенных для человека	возбудители, которые не способны к репликации или не вызывают поражений в тест- системах
2) скрининга производства	сбор необработанного продукта или лизат клеток и их культуральные среды из промышленного реактора
Скрининг вируса in vitro для:		широкий спектр вирусов, патогенных для человека	возбудители, которые не способны к репликации или не вызывают поражений в тест- системах
1) характеристики Банка клеток	лизат клеток и их культуральная среда (при совместном культивировании исследуемый материал должен содержать интактные клетки)
2) скрининга производства	сбор необработанного продукта или лизат клеток и их культуральные среды из промышленного реактора
Трансмиссионная электронная микроскопия на:		вирус и вирусоподобные частицы	качественный анализ с оценкой идентичности
1) клеточном субстрате	жизнеспособные клетки
2) супернатанте клеточной культуры	бесклеточный супернатант культуры
Обратная транскриптаза (RT)	бесклеточный супернатант культуры	ретровирусы и экспрессированная ретровирусная обратная транскриптаза	определяет только ферменты с оптимальной активностью при предпочтительных условиях, интерпретация может представлять сложность в связи с наличием клеточных ферментов, фона в некоторых концентрированных образцах
Инфицирующая способность ретровирусов (RV)	бесклеточный супернатант культуры	инфекционные ретровирусы	ретровирусы, не способные реплицироваться или не формирующие дискретные очаги или бляшки в выбранной тест-системе
Совместное культивирование	жизнеспособные клетки	инфекционные ретровирусы	ретровирусы, не способные реплицироваться
1) конечная точка инфицирующей способности			ретровирусы, не способные реплицироваться или не формирующие дискретные очаги или бляшки в выбранной тест-системе
2) конечная точка трансмиссионной электронной микроскопии			качественный анализ с оценкой идентичности кроме того, сложно отличить исследуемый материал от индикаторных клеток
3) конечная точка обратной транскриптазы			определяет только ферменты с оптимальной активностью при предпочтительных условиях. интерпретация может представлять сложность в связи с наличием клеточных ферментов, фона в некоторых концентрированных образцах
ПЦР	клетки, культуральная жидкость и прочие материалы	специфичные последовательности вируса	должны присутствовать праймеры, не определяет инфицирующую способность вируса

Собранный материал, в котором обнаружен посторонний вирус, не должен использоваться для производства продукта. Если на этом этапе выявляют посторонние вирусы, процесс производства необходимо тщательно проанализировать для определения причины контаминации и принятия соответствующих мер. ^[12] необходимость анализа возможностей процессов очищать продукт от вирусов, о наличии которых известно, и потребность оценки устойчивости процесса путем описания очистки от неспецифических «модельных» вирусов. При оценке вирусной безопасности препарата для анализа процесса необходимо знать количество вирусов, которые могут содержаться в нем (например, в необработанном нерасфасованном продукте) и количество вирусов, которые можно инактивировать и элиминировать в процессе очистки. Знание временной зависимости процедур инактивации позволяет удостовериться в их эффективности. При анализе очистки от известных контаминантов требуются проведение детальных зависимых от времени исследований инактивации, подтверждение воспроизводимости инактивации и (или) элиминации и анализ параметров процесса. При описании процесса производства с точки зрения надежности очистки с использованием неспецифичных «модельных» вирусов в дизайне исследования необходимо уделить особое внимание безоболочечным вирусам. Объем исследований, необходимых для описания очистки от вирусов зависит от результатов испытания клеточных линий и необработанного продукта. Такие исследования необходимо проводить по методологии, предусмотренной разделом 6 настоящей главы.Поскольку большинство используемых методик может изменяться с учетом научного прогресса, возможно использование альтернативных подходов при наличии данных, обосновывающих их применение. Производителям рекомендуется обсуждать такие альтернативные подходы с уполномоченными органами государств-членов. В отдельных ситуациях может потребоваться проведение других испытаний. Испытания должны включать в себя надлежащие контрольные материалы, гарантирующие достаточную чувствительность и специфичность. Во всех случаях, когда по виду животного – источнику происхождения клеточного субстрата – можно с относительно высокой вероятностью выявить наличие определенного вируса, может потребоваться проведение специальных испытаний и (или) применение других подходов. Если используемая в производстве клеточная линия получена от человекообразных или нечеловекообразных обезьян, необходимо дополнительно (при отсутствие должного обоснования) проверить ее на наличие таких вирусов человека, как вирусы, вызывающие иммунодефициты или гепатиты. Для выявления последовательностей нуклеиновых кислот, характерных для этих и других специфичных вирусов, может использоваться ПТТР. Далее представлено краткое описание общих принципов положений, в соответствии с которыми производитель должен обосновать свои действия.

B.I. Испытания на наличие ретровирусов.

При испытании клеток ГБК и клеток, культивируемых до предельного для производства клеточного возраста in vitro и дольше, следует проводить испытания на наличие ретровирусов, включая оценку инфицирующей способности на чувствительных клеточных культурах и электронную микроскопию. Если инфицирующая способность не выявлена и при помощи электронной микроскопии не были обнаружены ретровирусы или ретровирусоподобные частицы, проводятся исследования с использованием обратной транскриптазы или другие подходящие испытания на ретровирусы, которые могут не иметь инфицирующей способности. Исследования индукции в данном случае неэффективны.

3.B.2. Исследования in vitro.

Исследования in vitro проводятся путем инокуляции исследуемого материала, указанного в таблице 2, в разные восприимчивые индикаторные клеточные культуры, что позволяет определять большое число вирусов человека и животных. Выбор клеток для испытаний определяется видами животных, из которых получен подлежащий испытанию банк клеток, при этом необходимо включить клеточные линии человекообразных или нечеловекообразных обезьян, чувствительные к вирусам человека. Метод и материал для исследования выбираются в зависимости от типа вируса, наличие которого в материале предполагается с учетом происхождения клеток и проведенных с ними манипуляции. Необходимо проводить выявление как цитопатических, так и гемадсорбирующих вирусов.

3.B.3. Исследования in vivo.

Для выявления некультивируемых вирусов (не растущих в клеточных культурах) исследуемый материал, указанный в таблице 2, вводится животным, включая новорожденных и взрослых мышей, а также в развивающиеся эмбрионы птиц. В зависимости от происхождения исследуемых клеточных линий возможно проведение исследований на других видах животных. Следует контролировать состояние здоровья опытных животных, и любые отклонения от нормы нужно исследовать с целью установления причины заболевания.

3.B.4. Испытания на образование антител.

Видоспецифичные вирусы, присутствующие в клеточных линиях грызунов, можно выявить путем инокуляции исследуемого материала, указанного в таблице 2, не зараженным вирусом (безвирусным) животным с последующим определением сывороточных антител или ферментативной активности, проявляющихся спустя определенное время. В качестве примера можно привести тесты продукции мышиных (MAP), крысиных (RAP) и хомячьих (HAP) антител. Перечень вирусов, для выявления которых проводятся испытания продукции антител, приведен в таблице 3.

Вирусы, для выявления которых проводятся испытания продукции антител

Таблица 3

Тест продукции мышиных (map) антител	Тест продукции хомячьих (hap) антител	Тест продукции крысиных (rap) антител
2 3 Вирус эктромелии ’	Вирус лимфоцитарного 1,3 хориоменингита (LCM)	Вирус хантаан^1,3
Вирус хантаан^1,3	Вирус пневмонии мышей (PVM)^2,3	Крысиный вирус Килхама (KRV)^2,3
K-вирус²	1 3 Реовирус типа 3 ^ео3) ’	Вирус энцефаломиелита мышей (Theilers, GDVII)²
Вирус лактатдегидрогеназы (LDM)^1,3	Вирус Сендай^1,3	Вирус пневмонии мышей (PVM)^2,3
Вирус лимфоцитарного 1,3 хориоменингита (LCM) Мелкий вирус мышей ’ Аденовирус мышей (MAV)2,3 Цитомегаловирус мышей (MCMV)^2,3 Вирус энцефаломиелита мышей (Theilers, GDVII)²Вирус гепатита мышей (MHV)²	SV5	Коронавирус крыс (RCV)² 1,3 Реовирус типа 3 ^ео3) ’ Вирус Сендай ^1,3 Вирус сиалодакриоадеита (SDAV)² Вирус Тоолан (HI)^2,3

Ротавирус мышей

(EDIM)^2,3

Вирус пневмонии мышей

(PVM)^2,3

Полиомавирус^[9]^{[10] [11]}

Реовирус типа 3 (Яео3) ’

Вирус Сендай^1,3Тимический вирус²

^[1] Вирусы, для которых доказана их способность инфицировать человека или приматов.

_[2]Вирусы, для которых данные, доказывающие способность инфицировать человека, отсутствуют.

_[3]Вирусы, способные реплицироваться in vitro в клетках человека или приматов.

3.C. Приемлемость клеточных линий

Некоторые клеточные линии, используемые для производства продукта, содержат эндогенные ретровирусы, другие вирусы или вирусные последовательности. Рекомендации по организации производства в таких случаях описаны в разделе 5 настоящей главы. Приемлемость клеточных линий, содержащих вирусы, не являющиеся эндогенными ретровирусами, определяется в индивидуальном порядке уполномоченными органами государств-членов с учетом анализа пользы и риска, исходя из пользы препарата и его предлагаемого клинического применения, свойств контаминирующих вирусов, их потенциала заражать человека или вызывать у него заболевания, процесса очистки препарата (например, анализ данных очистки от вирусов) и объема проведенных с очищенным нерасфасованным продуктом испытаний на вирусы.

Испытание необработанного нерасфасованного продукта на наличие вирусов

Необработанный нерасфасованный продукт представляет собой один или несколько объединенных сборов клеток и культуральной среды. Если доступ к клеткам затруднен (например, при использовании полых волокон или аналогичных систем), то необработанный продукт может представлять собой жидкость, собранную из такого биореактора. Репрезентативный образец необработанного продукта, отобранного из промышленного биореактора перед дальнейшей обработкой, является одним из наиболее подходящих материалов, на котором можно с высокой вероятностью выявить контаминацию посторонними вирусами. Соответствующие испытания на наличие вирусов можно проводить на необработанном продукте, если только начальная частичная обработка не повышает чувствительность испытаний на вирусы (например, необработанный продукт может быть токсичным для исследуемых клеточных культур, в то время как частично обработанный продукт может быть нетоксичным).

В определенных случаях более приемлемым может быть анализ смеси, содержащей как интактные, так и разрушенные клетки и культуральные супернатанты, отобранные из промышленного биореактора перед последующей обработкой. В регистрационное досье необходимо включить данные, полученные как минимум на 3 сериях необработанного продукта, произведенного в опытно-промышленном или промышленном масштабе производства.

Производителям рекомендуется разрабатывать программы постоянной оценки на наличие посторонних вирусов в промышленных сериях продукта. Объем, количество и частота проведения испытаний на наличие вирусов в необработанном продукте определяется с учетом нескольких факторов: природы клеточных линий, используемых для производства требуемого лекарственного препарата, результатов и объема испытаний на наличие вирусов, проведенного во время квалификации клеточных линий, метода культивирования, источников сырья и результатов исследований по очистке от вирусов. В целях испытания необработанного продукта, как правило, проводятся скрининговые испытания in vitro с использованием одной или нескольких клеточных линий. При необходимости могут применяться методы на основе ПЦР или другие подходящие методы.

5. Обоснование и план действий при проведении исследований по очистке от вирусов и испытаний на наличие вирусов в очищенном нерасфасованном продукте

Необходимо разработать наиболее подходящий и рациональный протокол проведения испытаний на наличие вирусов начиная с ГБК на разных этапах производства вплоть до получения лекарственного препарата, включая оценку и характеристику эффективности очистки от вирусов необработанного продукта. Оценка и описание

характеристик очистки от вирусов играют основную роль в данной схеме, их целью является получение надежного подтверждения того, что продукт не контаминирован вирусами.

При выборе вирусов, которые будут использоваться в исследовании по очистке от вирусов, целесообразно разделять необходимость анализа возможностей процессов очищать продукт от вирусов, о наличии которых известно, и потребность оценки устойчивости процесса путем описания очистки от неспецифических «модельных» вирусов. При оценке вирусной безопасности препарата для анализа процесса необходимо знать количество вирусов, которые могут содержаться в нем (например, в необработанном нерасфасованном продукте) и количество вирусов, которые можно инактивировать и элиминировать в процессе очистки. Знание временной зависимости процедур инактивации позволяет удостовериться в их эффективности. При анализе очистки от известных контаминантов требуются проведение детальных зависимых от времени исследований инактивации, подтверждение воспроизводимости инактивации и (или) элиминации и анализ параметров процесса. При описании процесса производства с точки зрения надежности очистки с использованием неспецифичных «модельных» вирусов в дизайне исследования необходимо уделить особое внимание безоболочечным вирусам. Объем исследований, необходимых для описания очистки от вирусов зависит от результатов испытания клеточных линий и необработанного продукта. Такие исследования необходимо проводить по методологии, предусмотренной разделом 6 настоящей главы.

Пример плана действий при проведении анализа процесса, описания очистки от вирусов и испытаний на вирусы очищенного продукта в зависимости от результатов испытаний клеток и (или) необработанного продукта на вирусы приведен в таблице 4.

Таблица 4

Пример плана действий при проведении процесса очистки от вирусов и
испытаний на вирусы в очищенном продукте

Ситуация
Статус	1	2	3^[13]^[14]	4²	5²
Наличие вируса¹	–	—	+	+	(+)^[15]^[16]
Вирусоподобные частицы¹	—	—	—	—	(+)³
Ретровирусоподобные частицы¹	—	+	—	—	(+)³
Выявлен вирус	не применимо	+	+	+	—
Вирус, патогенный для человека	не применимо	4	4	+	неизвестно
Действия
Характеристика процесса очистки от вирусов при использовании неспецифичных «модельных» вирусов	_да^[17]	_да⁵	_да⁵	_да⁵	_да^[18]
Оценка процесса очистки от вирусов при использовании «релевантных» или специфичных «модельных» вирусов	нет	да^[19]	да⁶	да⁶	да⁷
Испытания на наличие вируса в очищенном продукте	не применимо	да⁸	да⁸	да⁸	да⁸

1 Результаты испытаний на наличие вируса на уровне клеточного субстрата и (или) необработанного продукта. Как правило, не допускается использовать в производстве контаминированные вирусом клеточные культуры. Однако допускается использовать эндогенные вирусы (например, ретровирусы) или вирусы, являющиеся интегральной (составной) частью ГБК, если проведены надлежащие процедуры оценки вирусной очистки.

^[14] Использование в качестве источника материала, контаминированного вирусами (независимо от их инфекционности и (или) патогенности для человека), допускается в исключительных случаях.

^[15] Вирус обнаружен с помощью прямых или непрямых методов.

^[16] Считающийся непатогенным.

^[17] Необходимо провести описание очистки с помощью неспецифичных «модельных» вирусов.

^[18] См. описание ситуации E.

^[19] Необходимо провести оценку процесса с помощью «релевантных» или специфичных «модельных» вирусов.

Необходимо подтвердить с помощью подходящих методов, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью обнаружения искомого вируса, что в очищенном продукте вирусы не обнаруживаются. В регистрационном досье необходимо представить данные, по меньшей мере, о трех сериях необработанного продукта, полученного опытно-промышленным или промышленным способом. Однако определять наличие неинфекционных частиц в очищенном продукте из клеточных линий (например, клетки CHO), эндогенные частицы которых хорошо описаны и налажена их очистка, как правило, не требуется.

Далее рассматриваются различные варианты такого плана действий. Во всех случаях необходимо провести описание очистки с использованием неспецифичных «модельных» вирусов. Наиболее частыми являются ситуации 1 и 2. Клетки-продуценты,Необходимо подтвердить с помощью подходящих методов, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью обнаружения искомого вируса, что в очищенном продукте вирусы не обнаруживаются. В регистрационном досье необходимо представить данные, по меньшей мере, о трех сериях необработанного продукта, полученного опытно-промышленным или промышленным способом. Однако определять наличие неинфекционных частиц в очищенном продукте из клеточных линий (например, клетки CHO), эндогенные частицы которых хорошо описаны и налажена их очистка, как правило, не требуется.

Ситуация 1. Если в клетках и необработанном продукте вирусы, вирусоподобные частицы и ретровирусоподобные частицы не обнаружены, необходимо провести исследования элиминации и инактивации вирусов с использованием неспецифичных «модельных» вирусов.

Ситуация 2. Если обнаружены лишь ретровирусы грызунов или ретровирусоподобные частицы, которые считаются непатогенными (например, частицы A- и R-типов грызунов), необходимо провести анализ процесса с использованием специфичных «модельных» вирусов, например, вируса лейкоза мышей. Испытание очищенного продукта необходимо проводить с использованием подходящих методов, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью в отношении рассматриваемого вируса. В регистрационном досье необходимо представить данные по меньшей мере о 3 сериях очищенного продукта, полученных опытно-промышленным или промышленным способом. В качестве субстратов для производства препаратов часто используются такие клеточные линии, как CHO, C127, BHK и клеточные линии гибридомы мышей, в отношении которых данные о проблемах с безопасностью, обусловленных вирусной контаминацией препаратов, не поступали. В отношении клеточных линий, эндогенные частицы которых хорошо описаны и очистка которых налажена, определение наличия неинфекционных частиц в очищенном продукте, как правило, не требуется. Необходимо провести исследования с использованием неспецифичных «модельных» вирусов, как описано в ситуации 1.

Ситуация 3. Если клетки или необработанный продукт содержат вирусы (за исключением ретровирусов грызунов), в отношении которых неизвестна их способность инфицировать человека (например, вирусы, указанные в сноске 2 к таблице 3 настоящей главы, за исключением ретровирусов грызунов (ситуация 2)), в исследованиях по изучению элиминации и инактивации вирусов необходимо использовать обнаруженный вирус. Если обнаруженный вирус использовать невозможно, в целях подтверждения приемлемости очистки необходимо использовать «релевантный» или специфичный «модельный» вирус. Зависимая от времени инактивация идентифицированных (или «релевантных», или специфичных «модельных») вирусов на критических стадиях инактивации должна стать частью анализа процесса на предмет наличия таких вирусов. Испытание очищенного продукта необходимо проводить с использованием подходящих методов, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью в отношении рассматриваемого вируса. В регистрационном досье необходимо представить данные по меньшей мере о 3 сериях очищенного продукта, полученных опытно-промышленным или промышленным способом.

Ситуация 4. Если обнаружен известный патоген человека (например, описанный в сноске 1 к таблице 3 настоящей главы), использовать продукт допускается в исключительных случаях. В связи с этим в исследованиях по изучению элиминации и инактивации вирусов рекомендуется применять обнаруженный вирус с использованием подходящих методов, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью в отношении его. Если обнаруженный вирус использовать невозможно, необходимо использовать «релевантный» и (или) специфичный «модельный» вирус. Необходимо подтвердить способность процесса в ходе очистки и инактивации элиминировать и инактивировать отобранные вирусы. В ходе анализа процесса на ключевых этапах инактивации необходимо получить данные о зависимой от времени инактивации. Испытание очищенного продукта необходимо проводить с использованием подходящих методов, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью в отношении рассматриваемого вируса. В регистрационном досье необходимо представить данные по меньшей мере о 3 сериях очищенного продукта, полученных опытнопромышленным или промышленным способом.

Ситуация 5. Если в клетках или необработанном продукте обнаруживается вирус, который невозможно классифицировать с помощью имеющихся методов, продукт, как правило, считается непригодным, поскольку вирус может быть патогенным. В очень редких случаях при наличии убедительных и обоснованных причин для производства препарата с использованием такой клеточной линии перед продолжением процесса производства необходимо согласование с уполномоченным органом государства-члена.

Оценка и характеристика процедур очистки от вирусов

Анализ и описание процедур элиминации и (или) инактивации вирусов играют важную роль в обеспечении безопасности биологических (биотехнологических) препаратов. Контаминация биологических препаратов агентами, о наличии которых не было известно и это не предполагалось, происходила если эти препараты были получены из не описанных всесторонне клеточных линий. Оценка очистки от вирусов обеспечивает определенную уверенность в том, что все неизвестные, неподозреваемые и опасные вирусы будут элиминированы. Исследования следует проводить с надлежащим документированием и контролем.

Целями исследований по очистки от вирусов являются оценка этапов процесса производства, которые можно считать эффективными для инактивации (элиминации) вирусов, и количественная оценка суммарного снижения содержания вирусов в продукте с помощью этих этапов. Это достигается за счет преднамеренного одномоментного добавления значимого количества вирусов в необработанный материал и (или) к различным фракциям, получаемым на различных этапах процесса производства, и подтверждения того, что на последующих этапах достигается их необходимая элиминация или инактивация.

Если надлежащая очистка достигается за счет меньшего количества этапов, то оценивать и описывать с точки зрения оценки вирусной безопасности остальные этапы процесса производства не требуется. Следует помнить, что остальные этапы процесса производства могут косвенно влиять на достигнутую инактивацию (элиминацию). Производители должны объяснить и обосновать подход, использованный для проведения исследований по очистке от вирусов.

Снижение инфицирующей способности вирусов достигается за счет элиминации вирусных частиц или их инактивации. Необходимо описать возможные механизмы снижения инфицирующей способности вируса на каждом изученном этапе процесса производства и указать, достигнуты они за счет инактивации или элиминации. Исследование этапов инактивации необходимо спланировать таким образом, чтобы пробы отбирались в различные временные точки, при этом следует построить кривую инактивации в соответствии с подразделом 6.B.5 настоящей главы.

Исследования по оценке очистки от вирусов проводятся в целях подтверждения очистки от вирусов, которые содержатся в ГБК, и (или) обеспечения определенной степени уверенности в том, что посторонние вирусы, которые могли быть не выявлены или могли контаминировать процесс производства, были устранены. Факторы снижения вирусной нагрузки, как правило, выражаются в логарифмических координатах, то есть несмотря на то, что остаточная инфицирующая способность вируса никогда не будет снижена до нуля, ее можно значительно снизить с математической точки зрения.

В дополнение к исследованиям по очистке от вирусов, о наличии которых известно, необходимо провести исследования по оценке возможностей процесса элиминировать и (или) инактивировать другие вирусы. Цель исследований с использованием вирусов, которые обладают различными биохимическими и биофизическими свойствами, о содержании которых неизвестно или наличие которых не ожидается, заключается, как правило, в изучении надежности процедур, но не в обеспечении определенной степени их инактивации или элиминации (специфического риска). Желательно обеспечить подтверждение способности процесса производства инактивировать или элиминировать вирусы в соответствии с подразделом 6.C настоящей главы. Такие исследования не направлены на оценку специфического (определенного) риска безопасности, то есть не требуется достигать определенной степени очистки для данного риска.

6.A. Выбор вирусов для оценки и характеристики элиминации вирусов

Чтобы испытать общую способность системы очищать продукт от вирусов, в исследования по оценке очистки и описанию процесса необходимо включать вирусы, напоминающие по свойствам вирусы, которые могут контаминировать препарат и обладают широким диапазоном физико-химических свойств. Руководствуясь настоящей главой, производитель должен обосновать выбор вирусов в соответствии с целями исследований по оценке и описанию и на основании настоящей главы.

6.А.1. «Релевантные» вирусы и «модельные» вирусы.

Основным аспектом проведения исследования по очистке от вирусов является определение, какие вирусы в него включать. Такие вирусы делятся на три категории: «релевантные» вирусы, специфичные «модельные» вирусы и неспецифичные «модельные» вирусы.

Необходимо подтвердить способность процесса очистки и (или) инактивации удалять и (или) инактивировать «релевантные» вирусы. Если «релевантного» вируса нет в наличии или он не адаптирован к исследованиям по оценке процесса очистки от вирусов (например, его невозможно вырастить в достаточно высоком титре in vitro), в качестве замены необходимо использовать специфичные «модельные» вирусы.

Клеточные линии, полученные от грызунов, обычно содержат частицы эндогенного ретровируса или ретровирусоподобные частицы, которые могут быть инфекционными (частицы С-типа) или неинфекционными (цитоплазматические частицы A- и R-типа). Необходимо определить способность процесса производства элиминировать и (или) инактивировать ретровирусы в продуктах, полученных с использованием таких клеток. Этого можно достичь с использованием вируса лейкемии мышей – специфичный «модельный» вирус для клеток мышиного происхождения. Например, при иммортализации B-лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр (EBV) и получении клеточных линий человека, секретирующих моноклональные антитела, необходимо определить способность процесса производства элиминировать и (или) инактивировать вирус герпеса. В качестве специфичного «модельного» вируса может также использоваться вирус псевдобешенства.

Если целью служит описание общей способности процесса производства элиминировать и (или) инактивировать вирусы (описание надежности процесса очистки), необходимо провести исследования по характеристике очистки с использованием неспецифичных «модельных» вирусов, обладающих различными свойствами. В таком анализе могут применяться результаты исследований с «релевантными» и (или) специфичными «модельными» вирусами. Проводить испытания со всеми типами вирусов не требуется. Необходимо отдавать предпочтение вирусам, которые проявляют значительную устойчивость к физическим и (или) химическим воздействиям. Результаты изучения таких вирусов служат источником доказательных сведений об общей способности процесса производства элиминировать и (или) инактивировать вирусы. Выбор и количество использованных вирусов зависят от качества и степени описания клеточных линий и процесса производства.

Примеры подходящих «модельных» вирусов, обладающих широким диапазоном физико-химических структур, и примеры вирусов, использованных в исследованиях по очистке от вирусов, представлены в приложении № 2 к настоящей главе.

6.А.2. Рассмотрение других аспектов.

Предпочтительно использовать вирусы, которые можно вырастить (обогатить) до высокого титра, однако это не всегда возможно.

Необходимо располагать эффективной и надежной методикой количественного определения каждого использованного вируса на каждом исследуемом этапе производства.

Необходимо учитывать потенциальный вред здоровью, который может быть нанесен персоналу, проводящему исследования очистки.

6.B. Дизайн и обязательные условия проведения исследований по оценке и описанию характеристик очистки вирусов

6.В.1. Производственные помещения, оборудование и персонал.

В соответствии с правилами надлежащей производственной практики Союза, утверждаемыми Комиссией, вносить какие-либо вирусы в производственное оборудование не допускается. В связи с этим исследования по очистке от вирусов должны проводиться в отдельной лаборатории, оборудованной для работы с вирусами, персоналом с вирусологической квалификацией в сотрудничестве с производственным персоналом, занимавшимся планированием и подготовкой уменьшенной версии процесса очистки.

6.В.2. Система производства в уменьшенном масштабе.

Необходимо доказать валидность (пригодность) уменьшенного масштаба производства. Уровень очистки в уменьшенном масштабе должен максимально соответствовать методу производства. Необходимо подтвердить, что все параметры (хроматографическое оборудование, высота слоя сорбента колонки (column bed-height), линейная скорость потока (linear flow-rate), отношение скорости потока к объему слоя сорбента (flow-rate-to-bed-volume ratio) (время контакта), виды буферных растворов и гелей, значение pH, температура и концентрация белка, соли и продукта) максимально приближены к промышленному способу производства. Необходимо получить тот же профиль элюирования. В отношении процедур необходимо соблюдать аналогичные требования. Неизбежные отклонения необходимо проанализировать с точки зрения их влияния на результаты.

6.В.3. Анализ поэтапной элиминации вирусов.

При проведении исследований по очистке от вирусов желательно оценить вклад более чем одного этапа производства в элиминацию вирусов. Этапы, на которых, вероятнее всего, устраняются вирусы, необходимо отдельно оценить на предмет их способности элиминировать и инактивировать вирусы, при этом следует уделить особое внимание точному разграничению отдельных этапов. На каждом подлежащем испытанию этапе материал должен содержать достаточное количество вируса, необходимое для оценки эффективности каждого этапа. Как правило, на каждом подлежащем испытанию этапе вирус добавляется во внутрипроизводственный материал. В некоторых случаях, достаточно просто добавить вирус в высоком титре в необработанный продукт и измерять его концентрацию между последовательными этапами. Если элиминация вируса достигается с помощью процедур отделения, рекомендуется при необходимости и по возможности изучить распределение вирусной нагрузки по различным фракциям. Если на множестве этапов процесса производства используются вирулицидные буферные растворы, как часть оценки всего процесса допускается использовать альтернативные стратегии, например, параллельное добавление менее вирулицидных буферных растворов. Титр вируса необходимо определять до и после каждого исследуемого этапа. В целях обеспечения необходимой статистической значимости результатов необходимо использовать методики количественного определения инфицирующей способности с высокой чувствительностью и воспроизводимостью с достаточным числом повторностей. При достаточном обосновании допускается использовать количественные методики, не направленные на выявление инфицирующей способности. В целях обеспечения чувствительности методов во все методики по определению инфицирующей способности необходимо включать надлежащий вирусный контроль. К тому же необходимо принимать во внимание особенности отбора проб вируса в низких концентрациях в соответствии с требованиями к статистическим подходам к интерпретации результатов испытаний на вирусы согласно приложению № 3 к настоящей главе.

6.В.4. Определение вклада физической элиминации и инактивации вирусов.

Снижение инфицирующей способности вируса достигается за счет его элиминации или инактивации. Необходимо описать возможные механизмы снижения инфицирующей способности вируса на каждом изученном этапе процесса производства и указать, достигнуты они за счет инактивации или элиминации. Если процесс производства не позволяет добиться удовлетворительного снижения инфицирующей способности, а элиминация вируса рассматривается в качестве основного фактора безопасности препарата, необходимо внедрить специальные или дополнительные этапы инактивации и (или) элиминации. На определенном этапе может потребоваться разграничить элиминацию и инактивацию (например, если есть вероятность того, что буферный раствор, использованный более чем на одном этапе, может влиять на инактивацию на каждом этапе, то есть влияние буферного раствора на инактивацию распределяется между несколькими хроматографическими этапами, при этом необходимо определить степень элиминации, достигаемую за счет каждого из этих хроматографических этапов).

6.В.5. Оценка инактивации.

Для оценки инактивации вируса в необработанном продукте или промежуточном материале должен быть введен инфекционный вирус и рассчитан фактор (коэффициент) снижения вирусной нагрузки. Следует учитывать, что инактивация вируса не является простым процессом первого порядка, обычно она более сложная и имеет быструю фазу 1 и медленную фазу 2. Именно поэтому исследование должно быть спланировано так, чтобы отбор проб проводился в разные временные точки, и была построена кривая инактивации. В исследования по инактивации помимо временной точки, соответствующей минимальной экспозиции, рекомендуется включать не менее одной временной точки, которая предшествует точке минимальной экспозиции и отличается от ноля. Дополнительные данные особенно необходимы, если «релевантный» вирус является патогенным для человека и создан процесс эффективной его инактивации. Однако в исследованиях инактивации, в которых неспецифичные «модельные» вирусы или специфичные «модельные» вирусы используются в качестве суррогатов вирусных частиц (например, внутрицитоплазматические ретровирусоподобные частицы в клетках яичника китайского хомячка) воспроизводимость очистки необходимо подтвердить по меньшей мере в 2 исследованиях. Начальную вирусную нагрузку по возможности необходимо определять путем выявления вируса после его добавления в исходный материал. Если это невозможно, то начальная вирусная нагрузка рассчитывается по титру вируса в добавляемом к исходному материалу препарате. Если высокая скорость инактивации не позволяет построить кривую инактивации с использованием условий процесса, необходимо предусмотреть надлежащие контроли, в целях подтверждения того, что в ходе инактивации инфицирующая способность была устранена.

6.В.6. Использование и регенерация хроматографических колонок.

Со временем или при повторном (многократном) использовании хроматографических колонок и других систем, используемых в процессе очистки, их способность к элиминации вируса может изменяться. Определение стабильности очистки от вирусов после многократного применения оправдывает возможность повторного использования колонок. Необходимо подтвердить, что вирусы, которые были потенциально задержаны производственной системой, должным образом уничтожены и удалены перед повторным ее использованием. Таким подтверждением, к примеру, может служить демонстрация того, что процедуры очистки и регенерации инактивируют или элиминируют вирус.

6.В.7. Особые меры предосторожности.

При приготовлении вирусов в высоком титре необходимо соблюдать осторожность, чтобы не допустить их агрегации, которая может улучшить физическую элиминацию, но снизить инактивацию и исказить таким образом корреляцию с фактическим производством.

Необходимо учитывать минимальное количество вируса, содержание которого можно достоверно определить.

В целях анализа снижения инфицирующей способности вируса вследствие разведения, концентрации, фильтрации или хранения проб перед их разведением, в исследование необходимо включать параллельные контрольные методики количественного определения.

«Добавление» вирусов необходимо осуществлять в небольшом объеме, чтобы не разводить продукт или не изменить его свойства. Проба испытуемого белка после его разведения больше не является идентичной продукту, получаемому промышленным способом.

Небольшие различия в буферных растворах, питательной среде, реактивах и т. п. могут значительно повлиять на очистку от вирусов.

Инактивация вирусов зависит от времени, поэтому время, в течение которого продукт, в который добавлен вирус, остается в определенном буферном растворе или определенной хроматографической колонке, должно соответствовать условиям промышленного процесса производства.

Буферные растворы и продукт необходимо оценивать отдельно на токсичность и влияние на результаты методик, применяемых для определения титра вируса, так как эти компоненты могут негативно влиять на индикаторные клетки. Если такие растворы токсичны для индикаторных клеток, могут потребоваться разведение, коррекция pH или диализ буферного раствора, содержащего добавленный вирус.

Если продукт обладает собственной противовирусной активностью, может потребоваться проведение исследования очистки без продукта в «имитационном» цикле («mock» run), хотя при этом исключение продукта или замена его на аналогичный белок, не обладающий противовирусной активностью, может повлиять на поведение вирусов на некоторых этапах производства. Необходимо включить достаточные контроли для оценки влияния процедур, используемых исключительно для приготовления проб для методик определения (например, диализ, хранение), на элиминацию и (или) инактивацию добавленного вируса.

Во многих схемах очистки повторно используются одинаковые или схожие буферные растворы или колонки. При анализе данных это необходимо принимать во внимание. Эффективность конкретного метода элиминации вируса может зависеть от этапа производства, на котором он используется.

Если условия производства или буферные растворы чрезмерно цитотоксичны или вирулицидны, совокупные факторы (коэффициенты) снижения вирусной нагрузки могут быть недооценены, в этом случае оценка проводится в индивидуальном порядке. Ввиду внутренних ограничений или несоответствующего дизайна исследований по очистке от вирусов общие факторы (коэффициенты) снижения вирусной нагрузки могут быть также переоценены.

6.C. Интерпретация результатов исследований по очистке от вирусов

Целями оценки инактивации и (или) элиминации вирусов являются анализ и описание этапов процесса производства, считающихся эффективными для инактивации и (или) элиминации вирусов, и количественное определение общего снижения содержания вирусов, достигаемого при производстве. При наличии вирусных контаминантов (ситуации 2 – 5), чтобы обеспечить надлежащий уровень безопасности лекарственного препарата, необходимо не только подтвердить, что вирус элиминирован или инактивирован, но и показать, что в процессе очистки от вирусов остается запас эффективности. Количество элиминированного или инактивированного в ходе процесса производства вируса необходимо сравнить с количеством, которое содержалось в необработанном продукте.

Для осуществления такого сравнения необходимо оценить содержание вируса в необработанном продукте. Такая оценка осуществляется с использованием методик определения инфицирующей способности или иных методик, например, трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Весь процесс очистки должен элиминировать значительно большее количество вируса, чем его содержание в объеме необработанного продукта, эквивалентном одной дозе лекарственного препарата. Расчет факторов (коэффициентов) снижения вирусной нагрузки в исследованиях по очистке от вирусов осуществляется согласно приложению № 4 к настоящей главе, расчет ожидаемого количества частиц на дозу – согласно приложению № 5 к настоящей главе.

Механизмы очистки от различных классов вирусов могут отличаться. При анализе данных, подтверждающих эффективность процедур инактивации и (или) элиминации вирусов, необходимо использовать комбинацию факторов:

пригодность использованных тест-вирусов;
дизайн исследований очистки;
достигнутое снижение вирусной нагрузки (в логарифмах);
зависимость инактивации от времени;
потенциальное влияние изменения параметров процесса производства на инактивацию и (или) элиминацию вируса;
чувствительность (пределы определения и обнаружения) аналитических методик;
селективность процедур инактивации и (или) элиминации в отношении определенных классов вирусов.

Эффективная очистка достигается любым из следующих способов: многоэтапная инактивация, многоэтапное дополнительное отделение или комбинация этапов инактивации и отделения. Отделение «модельных» вирусов может происходить иначе, нежели отделение искомого вируса, поскольку методы отделения могут зависеть от высокоспецифичных физико-химических свойств вируса, которые влияют на их взаимодействие с гелевыми матрицами и на свойства преципитации. Параметры производства, влияющие на отделение, подлежат надлежащему описанию и контролю. Различия могут быть обусловлены изменением поверхностных свойств, например, гликозилированием. Однако, несмотря на такие потенциальные различия, эффективная элиминация достигается путем комбинации дополнительных этапов отделения или комбинации этапов инактивации и отделения. Таким образом, хорошо спланированные этапы отделения, например, хроматографические процедуры, фильтрация и экстракция, могут оказаться эффективными способами элиминации вирусов, если они осуществляются в хорошо контролируемых условиях. Эффективный этап элиминации вирусов должен обладать воспроизводимостью в отношении снижения вирусной нагрузки, которую необходимо подтвердить не менее чем двумя независимыми исследованиями.

Совокупный фактор (коэффициент) снижения, как правило, выражается в виде суммы отдельных факторов. Если индивидуальный фактор (коэффициент) снижения составляет 1,0 lg или менее, то он признается незначительным и при отсутствии обоснования не учитывается в расчете совокупного фактора (коэффициента) снижения.

Если процесс производства не позволяет добиться удовлетворительного снижения инфицирующей способности, а элиминация вируса рассматривается в качестве основного фактора безопасности препарата, необходимо внедрить дополнительные этапы инактивации и (или) элиминации. В отношении всех вирусов производители должны обосновать приемлемость полученных факторов (коэффициентов) снижения. Результаты должны быть оценены на основании указанных факторов.

6.D. Ограничения исследований по очистке от вирусов

Исследования по очистке от вирусов влияют на обеспечение приемлемого уровня безопасности лекарственного препарата, однако сами по себе не определяют его безопасность. Тем не менее ряд элементов дизайна и выполнение исследований по очистке от вирусов могут привести к некорректной оценке способности процесса снижать инфицирующую способность вирусов. К таким факторам относятся следующие:

Вирусные препараты, использованные в исследованиях по очистке, как правило, получают на культуре тканей. Поведение вируса из культуры ткани на этапе производства может отличаться от свойств природного вируса, например, если природный и выращенный вирусы различаются по чистоте или степени агрегации.

Инактивация инфицирующей способности вирусов, как правило, описывается двухфазной кривой, в которой быстрая начальная фаза сменяется медленной. Существует вероятность, что вирусы, оставшиеся после первого этапа инактивации, могут быть более устойчивыми к последующим этапам. Например, если резистентная фракция принимает форму вирусных агрегатов, их инфицирующая способность может быть устойчива к различным химическим воздействиям и нагреванию.

Возможность совокупного процесса снижать инфицирующую способность выражается в виде суммы логарифмов снижения вирусной нагрузки на каждом этапе. Суммирование факторов (коэффициентов) снижения на различных этапах, особенно этапах с небольшим снижением (например, менее 1,0 lg), может привести к завышению истинного показателя оценки элиминации вируса. Кроме того, не допускается суммировать факторы (коэффициенты) снижения, полученные за счет повторения идентичных или схожих процедур, без должного снования.

Выражение факторов (коэффициентов) снижения в виде логарифма снижения титра означает, что, несмотря на существенное снижение остаточной инфицирующей способности вируса, она никогда не снизится до нуля. Например, снижение инфицирующей способности препарата, содержащего 8,0 lg инфицирующих единиц на миллилитр, на фактор 8,0 lg дает 0,0 lg на миллилитр или одну инфицирующую единицу на миллилитр с учетом предела обнаружения методики.

Опытно-промышленный способ обработки может отличаться от промышленного, даже несмотря на дизайн процесса с уменьшенным масштабом.

Сложение индивидуальных факторов (коэффициентов) снижения вирусной нагрузки, достигнутых за счет схожих механизмов инактивации, может привести к переоценке совокупной очистки от вирусов.

6.E. Статистический анализ данных

В целях интерпретации результатов исследований очистки от вирусов они должны включать в себя статистический анализ данных. Для подтверждения полученных выводов результаты исследования должны быть статистически значимы в соответствии с приложением № 3 к настоящей главе.

6.F. Повторная оценка очистки от вирусов

При значимых изменениях процесса производства или очистки необходимо оценить прямое и косвенное их влияние на очистку от вирусов и при необходимости подвергнуть систему повторной оценке. Например, изменения процессов производства могут служить причиной изменения продукции вирусов клеточной линией, изменения этапов производства могут повлиять на степень очистки от вирусов.

Заключение

В настоящей главе охарактеризованы подходы к оценке рисков вирусной контаминации и очистке от вирусов продукта, которые вносят вклад в производство безопасных биотехнологических препаратов, получаемых из клеточных линий человека или животных и описано значение ряда стратегий, включая:

тщательное описание (скрининг) исходного материала клеточного субстрата на предмет наличия вирусных контаминантов;
оценку риска путем выявления контаминантов, тропных к организму человека;
внедрение надлежащей программы испытаний на посторонние вирусы в необработанном продукте;
детальное планирование исследований очистки от вирусов с использованием различных методов инактивации или элиминации вирусов в одном и том же процессе производства с целью достижения максимальной очистки от вирусов;
проведение исследований, направленных на анализ инактивации и элиминации вирусов.

Приложение №1

ТРЕБОВАНИЯ к препаратам полученным из охарактеризованных банков клеток, которые были впоследствии выращены in vivo

Приложение №2

ПЕРЕЧЕНЬ вирусов, используемых в исследованиях по очистке от вирусов

Приложение № 3

Требования к статистическим подходам интерпретации результатов испытания на вирусы

Приложение №4

Указания по расчету факторов (коэффициентов) снижения вирусной нагрузки в исследованиях для определения очистки от вирусов

Приложение №5

Указания по расчету ожидаемого количества вирусных частиц на дозу