Глава 7. Примеси ДНК и белков клетки-хозяина, стандартные испытания в сравнении с валидационными исследованиями

Глава 7. Примеси ДНК и белков клетки-хозяина, стандартные испытания в сравнении с валидационными исследованиями

 

1. Область применения

 
Биотехнологические препараты, преимущественно рекомбинантные белки, получают с помощью сложной системы экспрессии (производства) с использованием генетически модифицированных клеток (клеток бактерий, дрожжей или млекопитающих). Среди примесей, подлежащих удалению в процессе очистки на конечном этапе производства, 2 компонентами, представляющими наибольший интерес с точки зрения безопасности и переносимости, являются остаточная ДНК клетки-продуцента и остаточные белки клетки-хозяина. С момента регистрации первых рекомбинантных белков применяются разные подходы, основанные преимущественно на разновидностях систем производства, для работы с данными примесями. В качестве стандартного испытания на белки клетки-хозяина независимо от типа получаемого препарата и используемой клеточной системы необходимо определять остаточные белки клетки-хозяина, в то время как исследования остаточной ДНК в качестве стандартного испытания проводят только для препаратов, полученных из перевиваемых клеточных линий млекопитающих.
Необходимо гарантировать, что содержание таких примесей в лекарственном препарате, предназначенном для пациента, снижено до допустимого уровня. Для достижения этой цели следует рассмотреть два подхода:
  • валидационный подход: выполнить валидацию процесса производства для демонстрации того, что на заданных этапах процесса очистки эти примеси последовательно и воспроизводимо удаляются до тех пор, пока их уровень не станет приемлемым. Основываясь на коэффициентах снижения содержания примесей, можно предсказать и гарантировать остаточный уровень примеси в готовом препарате;
  • стандартный подход: разработать аналитические методики, позволяющие максимально точно контролировать уровень этих примесей на разных этапах процесса, и установить фиксированное предельное содержание примесей, что позволит надлежащим образом контролировать содержание таких примесей в готовом препарате.
Можно комбинировать эти два подхода, т.е. проводить стандартное испытание на раннем этапе процесса очистки, а валидационное испытание, демонстрирующее уменьшение содержания примесей, проводить на готовом препарате для выявления максимального содержания примесей.
Учитывая возможность применения рекомбинантных белков в международном масштабе, необходимо гармонизировать критерии оценки на международном уровне, чтобы производители могли разрабатывать свои препараты на одних и тех же производственных линиях, независимо от предполагаемых регионов регистрации и вывода препарата на рынок.
 

2. Остаточная ДНК клетки-продуцента

 
В отношении препаратов, полученных с помощью бактерий и дрожжей нет необходимости проводить стандартные испытания при условии, что в готовом препарате не превышены допустимые уровни остаточной ДНК, а в досье представлены достаточные данные по валидации. ДНК из стабильной клеточной линии млекопитающих ранее считалась фактором риска из-за опасений, что остаточная ДНК клетки-хозяина может обладать туморогенным потенциалом. Однако полученная в дальнейшем информация показала, что ДНК из стабильной клеточной линии представляет риск в гораздо меньшей степени, чем предполагалось раньше, и, следовательно, должна относиться к категории общих примесей.
Валидационные испытания (например, эксперименты по внесению заданных количеств примеси с соответствующим распределением фрагментов ДНК по размерам) должны проводиться с целью выявления основных этапов, на которых возможно снижение содержания ДНК, а также для занесения в документацию данных о способности данных этапов снижать содержание остаточной клеточной ДНК в готовом препарате до приемлемого и заданного уровней. В настоящее время методика количественного анализа ДНК подробно описана и обладает воспроизводимостью.
В дополнение к данным валидационных испытаний необходимо представить результаты количественного анализа ДНК для минимального количества производственных серий (например, 5 последовательных серий) с целью демонстрации воспроизводимости процесса производства в отношении снижения содержания остаточной ДНК до уровня, который предполагается получить в ходе валидационных испытаний. Учитывая удовлетворительные данные по валидации и достоверные результаты по ограниченному числу производственных серий, проведение стандартных испытаний для определения содержания ДНК в стабильной клеточной линии на этапе очистки нерасфасованного препарата (на других соответствующих этапах) представляется нецелесообразным.
В некоторых случаях (например, ранее не утвержденные перевиваемые клеточные линии, трансформация последовательностей ДНК вирусными векторами и т.д.) может возникнуть необходимость в применении стандартного контроля удаления ДНК.
Допустимо прекращение проведения стандартных испытаний ДНК для препаратов, выделенных из стабильных клеточных линий и для которых уже получено регистрационное удостоверение. Однако в таком случае необходимо внести официальные изменения в регистрационное досье. Документация с изменениями должна содержать удовлетворительные результаты валидационного испытания наряду с ретроспективными данными, полученными заявителем с момента начала производственного процесса, что подтвердит стабильный уровень содержания остаточной ДНК в ходе процесса.
 

3. Остаточные белки клетки-хозяина

 
Вопрос об остаточных белках клетки-хозяина затрагивает все системы экспрессии (производства), а не только экспрессионную систему с использованием клеток млекопитающих. Наличие в любых рекомбинантных белках таких примесей требует изучения потенциальной иммуногенности препарата. По этой причине в настоящее время необходимо контролировать содержание остаточных белков клетки-хозяина на этапе очистки нерасфасованного препарата с помощью подходящих методов анализа. Результаты испытаний от серии к серии должны соответствовать друг другу и находиться в установленных спецификацией пределах.
При определении допустимых пределов необходимо помнить, что невозможно установить общее предельное содержание остаточных белков клетки-хозяина для всех биотехнологических препаратов. Действительно, белки клетки-хозяина – примеси, качественная и количественная характеристика которых изменяется от одного препарата к другому и даже от одной системы производства (очистки) к другой. Стандартизация аналитических методов затруднена, поскольку выбор реагентов, используемых в ходе испытаний, зависит от получаемого препарата и системы экспрессии. В отношении остаточных белков клетки-хозяина трудно подобрать материал, обладающий схожими с примесями характеристиками, для использования на определенных этапах процесса или при использовании валидационного подхода (искусственно контаминированный материал).
В большинстве случаев при удалении белков используют хроматографические колонки, для которых избирательность (селективность) и выход методик зависят не только от качества материала, но также и от способа первичного и повторного использования колонок, условий хранения, санитарной обработки и периода их эксплуатации. Валидационный подход не может охватить все эти критические параметры.
В отношении остаточных белков клетки-хозяина валидационный подход применяют только для каждого препарата индивидуально с учетом:
  • качества аналитической методики, используемой для определения и количественного анализа примесей остаточных белков клетки хозяина;
  • дизайна и качества валидационных испытаний;
  • предполагаемого использования препарата (доза, показания, длительность лечения и т.д.).
 

4. Вывод

 
В большинстве случаев валидационный подход считается допустимым способом определения остаточного содержания ДНК клетки-хозяина.
Этот подход не так широко используется в отношении таких примесей, как белки клетки-хозяина, при анализе которых предпочтительно использовать индивидуальный подход для каждого препарата.
Необходимо отметить, что в любом случае нужно периодически проводить оценку процессов и методик анализа для подтверждения того, что при их использовании возможно достичь запланированных результатов.