ОФС.1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы испытания специфической активности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков на их основе, которая определяется количеством жизнеспособных бактерий и активностью кислотообразования или их антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам.

Таким образом, описанные в настоящей статье микробиологические методы позволяют определить следующие показатели специфической активности испытуемого препарата или штамма:

– количество жизнеспособных бактерий в 1 дозе[1] иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП) (раздел 1);

– активность кислотообразования (раздел 2);

– антагонистическая активность (раздел 3).

ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Требования к специфической активности испытуемого препарата касаются определения количества живых бактерий в 1 дозе лекарственного средства, кислотообразующей активности штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения, и определения уровня антагонистической активности испытуемого препарата.

Контроль испытуемого препарата по показателю «Количество жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства» является обязательным при отработке новых технологий производства лекарственного средства, предварительном и сертификационном контроле, оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Определение количества живых микроорганизмов в испытуемой дозе проводят методом серийных разведений, при необходимости, с последующим высевом на питательные среды (Человеческая доза – доза испытуемого препарата, указанная на этикетке или в инструкции по медицинскому применению (листке-вкладыше)).

При проведении контроля поликомпонентных или комбинированных пробиотиков необходимо учитывать количество и соотношение всех видов или штаммов, входящих в состав препарата.

Показатель «Активность кислотообразования» является обязательным при контроле штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности.

Показатель «Антагонистическая активность» является обязательным при контроле колисодержащих и споровых пробиотиков для медицинского применения и производственных штаммов. Уровень антагонистической активности ИЛП в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов.

Производственные штаммы контролируются не реже 1 раза в год.

Питательные среды, используемые в испытаниях

Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения, используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в нормативной документации):

• для лактобактерий – МРС- 2, МРС- 4, МРС- 5, МРС- 1; для ацидофильных лактобактерий – стерильное обезжиренное молоко;
• для бифидобактерий – полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, среду Блаурокка с натрия азидом, МРС-5;
• для кишечной палочки – среду Эндо, мясопептонный агар (МПА), среду Гаузе № 2 агаризованную;
• для энтерококков – МПА, среду № 1;
• для бактерии рода Bacillus – среду Гаузе № 2 агаризованную, МПА, полусинтетическую среду с дрожжевым диализатом.

Питательные среды для проведения испытаний готовят в соответствии с приведенными ниже указаниями. Также могут использоваться эквивалентные коммерчески доступные среды при условии, что они выдерживают испытания на ростовые свойства. Необходимое значение рН питательных сред устанавливают при температуре (25 ± 2) ^оС.

Среда МРС-1

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

• марганец сернокислый 0,05 г
• цистеин солянокислый или L-цистин                    0,10 г
• магний сернокислый 0,200 г
• калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 2,00 г
• аммония цитрат 2,00 г
• натрия ацетат (натрий уксуснокислый)        5,00 г
• печеночный экстракт^а) (1:1)                   100,0 мл
• дрожжевой аутолизат^б) с содержанием
• аминного азота (0,15 ± 0,03) %                   50,0 мл
• пептон сухой ферментативный  10,00 г
• гидролизат обезжиренного молока^в)                   500,0 мл
• полисорбат 80                             1,00 мл
• глюкоза                                                                            20,00 г

Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл; рН среды (6,4 ± 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10 , 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (120 ± 2) ^оС в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения готовой стерильной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Примечание.

^а) Приготовление печеночного экстракта с содержанием аминного азота (0,050±0,005) %.

• Печень говяжья                            1,0 кг
• Вода очищенная                              1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112±5) ^оС в течение (20±1)  мин (процесс стерилизации валидируется).

Приготовление: 1,0 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3×3×3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 – 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре 120±2 ^оС в течение 15±1 мин. Срок хранения печеночного экстракта при температуре от 2 до 8 ^оС не более 6 мес или не более 3 мес при комнатной температуре.

^б) Приготовление дрожжевого аутолизата с содержанием аминного азота (0,15±0,03) %.

• Дрожжи хлебопекарные 1000 г
• Вода питьевая 4000 мл
• Хлороформ                             40 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин.

^в) Приготовление гидролизата обезжиренного молока по Богданову.

• Молоко коровье пастеризованное, нежирное (рН 6,7±0,1) 1000 мл
• Панкреатин                                                1,0 г
• Хлороформ                                                         5,0 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин.

 

Среда МРС-2

• Марганец сернокислый                                               0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин                   0,10 г
• Магний сернокислый 0,20 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный  2,00 г
• Аммония цитрат                    2,00 г
• Натрия ацетат                                                         5,00 г
• Печеночный экстракт (1:1)                    100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15 ± 0,03) %                                              50,0 мл

• Пептон сухой ферментативный  10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока           500,0 мл
• Полисорбат 80  1,00 мл
• Глюкоза  20,00 г
• Агар микробиологический           1,00 г
• Вода очищенная  до 1000 мл

Значение рН готовой среды (6,4 ± 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (120 ± 2) ^оС в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Среда МРС-4

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

• Марганец сернокислый 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин                             0,10 г
• Магний сернокислый                             0,200 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 2,00 г
• Аммония цитрат                                                        2,00 г
• Натрия ацетат  5,00 г
• Печеночный экстракт (1:1)                   100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием

аминного азота (0,15 ± 0,03) %                                              50,0 мл

• Пептон сухой ферментативный  10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока                   500,0 мл
• Полисорбат 80                   1,00 мл
• Глюкоза                                                                   20,00 г
• Агар микробиологический 19,0 г

Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл (рН 6,4±0,2). Питательную среду стерилизуют в автоклаве при температуре (120 ± 2) ^оС в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных флаконах или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Среда МРС-5

• Марганец сернокислый 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин                             0,10 г
• Магний сернокислый                             0,200 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 2,00 г
• Печеночный экстракт (1:1)                   100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15±0,03) %                                      50,0 мл

• Пептон сухой ферментативный  10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока                   500,0 мл
• Полисорбат 80                   1,00 мл
• Глюкоза                                                                   20,00 г
• Агар микробиологический 15,0 г
• Вода очищенная  до 1000 мл.

Питательную среду (рН 7,0) стерилизуют в автоклаве при температуре (120±2) ^оС в течение (15±1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных контейнерах (флаконах) или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Примечание.

Приготовление обезжиренного стерильного молока рН (6,7±0,3);

показатель кислотности не более 18 °Т:

• Молоко сухое обезжиренное  80 г
• Вода очищенная                    до 1000 мл

Разливают в пробирки по 10 , 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (60±1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения обезжиренного стерильного молока 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Модифицированная печеночная среда Блаурокка

• Печеночная вода (1:2) с содержанием аминного азота (100  ± 20) мг%                  1000 мл
• Пептон сухой           10 г

• Натрия хлорид                             5 г
• Лактоза                                      10 г
• Цистеин                             0,1 г
• Агар микробиологический          0,75 г

Устанавливают требуемое значение рН (7,2 ± 0,2) с помощью 20 % раствора натрия гидроксида. Питательные среды разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (60 ± 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС . После 14 сут хранения перед использованием для снижения содержания растворенного кислорода среду следует однократно регенерировать путем нагревания пробирок на водяной бане при температуре 70 – 80 °С в течение 10 – 15 мин.

Примечание.

Приготовление печеночной воды с содержанием аминного азота (100±20) мг %.

• Печень говяжья  0,5 кг
• Вода очищенная 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ±1 )  мин (процесс стерилизации валидируется).

0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3×3×3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 – 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения – не более 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Среда Блаурокка с азидом натрия

• Среда Блаурокка          1000 мл
• Натрия азид                    0,1 г

Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (112±5) ^оС в течение (20±1) мин. Срок хранения питательной среды 1 мес при температуре от 2 до 8 ^оС.

Среда Гаузе №2 агаризованная

• Бульон Хоттингера¹⁾ с содержанием аминного азота 700 мг%                         30 мл

• Пептон сухой 5 г
• Натрия хлорид 5 г
• Глюкоза  10 г
• Агар микробиологический 30 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Примечание.

Приготовление бульона Хоттингера (содержание аминного азота 700 мг%).

• Гидролизат Хоттингера 24,0 г
• Натрия хлорид 5,0 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).

Полусинтетическая среда с дрожжевым диализатом агаризованная·        Марганец хлористый 4-водный или марганец сернокислый                        0,01 г·        Железо(III) сернокислое 7-водное               0,01 г·        Магний сернокислый 7-водный илимагния хлорид 6-водный                                      0,1 г·        Кальция хлорид                                           0,08 г·        Пептон сухой                                                0,5 г·        Дрожжевой диализат с содержанием азота аминного 150 мг %                                      5,0 мл·        Глюкоза                                                       10,0 г·        Агар микробиологический                           20-30 г·        Вода очищенная                                          до 1000 мл.

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).

Мясопептонный агар (МПА)

• Пептон           10,0 г
• Натрия хлорид             5,0 г
• Мясная вода 300–500 мл
• Агар микробиологический 13–20 г

В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2–7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, зависящем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения агара. Разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют при  температуре 120 ^оС в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется.

Срок хранения готовой среды (pH 7,3 ± 0,2) 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Мясопептонный бульон (МПБ)

• Пептон 10,0 г
• Натрия хлорид    5,0 г
• Мясная вода  1000 мл.

В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2–7,4 и разливают в пробирки и флаконы. Стерилизуют при температуре 120 ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Примечание.

Приготовление мясной воды (1:2).

• Мясо–говядина (фарш)  500 г
• Вода очищенная 1000 мл

Стерилизация при температуре 121 ^оС в течение 20 мин. Срок хранения 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС  и не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Перед испытанием, в случае использования плотной питательной среды, по 10–15 или 20–25 мл расплавленной агаризованной питательной среды (при температуре около 45 ^оС) разливают в стерильные чашки Петри диаметром 9 или 12 см (соответственно), оставляют на горизонтальной поверхности и дают среде застыть. Поверхность агаризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды и проверки стерильности. Чашки Петри с питательными средами помещают закрытыми и перевернутыми вверх дном в термостат при температуре (37 ± 1) ^оС на 48 ч. Агар Эндо подсушивают 40 мин в ламинарном шкафу с открытыми крышками.

Раздел 1. Определение количества жизнеспособных бактерий в 1 дозе ИЛП

В настоящем разделе изложены общие принципы определения количества живых бактерий в пробиотиках для медицинского применения методом десятикратных разведений с высевом на плотные питательные среды (метод Коха) и глубинного чашечного метода или в жидкие и полужидкие среды (метод предельных разведений). Результаты количественного определения микроорганизмов выражаются в колониеобразующих единицах (КОЕ).

Отбор и подготовка образцов для анализа

От каждой испытуемой серии препарата пробиотика методом случайной выборки отбирают по 3 испытуемых образца.

Испытания проводят, соблюдая правила асептики.

Каждый образец в отдельности разводят стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида и перемешивают пипеткой 8–10 раз.

Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):

1. Лиофилизаты (флаконы) – каждый образец в отдельности ресуспензируют стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида (из расчета 1 мл на 1 дозу) и перемешивают пипеткой 8–10 раз, получая исходное разведение.
2. Порошки – содержимое пакета (саше) асептически пересыпают в стерильную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин, получая разведение 1:100 (10^-2).
3. Таблетки – каждый образец в отдельности предварительно растирают в стерильной ступке стерильным пестиком до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз, получая исходное разведение.
4. Капсулы – каждый образец в отдельности вносят в стерильные пробирки, добавляют 10 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. Пробирки с капсулами помещают на водяную баню при температуре (39±1)^оС. Через 10–30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10^-1).
5. Суппозитории–каждый образец в отдельности помещают в стерильные пробирки и добавляют предварительно нагретый до температуры (37 + 1) ^оС стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы суппозитория испытуемой серии (например, при массе 1,1 г добавляют 8,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, а при массе 2 г – 8 мл физиологического раствора). Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 10–30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10^-1).

Методика испытания

Испытание проводят методом последовательных десятикратных разведений, соблюдая правила асептики. Для этого 1 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение, разведения 10^-1 или 10^-2)  вносят пипеткой в пробирку, содержащую 9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10–15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10^-2  или 10^-3), и затем 1 мл суспензии переносят в следующее разведение. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.

В случае, если образец содержит 1 дозу, 0,5 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение) пипеткой  вносят в пробирку, содержащую 4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10–15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10^-1) и 1 мл суспензии переносят в пробирку с 9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, получая разведение 10^-2. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.

В зависимости от биологических свойств бактерий, входящих в состав испытуемого образца, используют соответствующую методику испытания.

1. Высев на плотные питательные среды

1.1 Метод Коха

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) ^оС в течение 24–96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу.

Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.

1.2. Глубинный чашечный метод

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20–25 мл расплавленной и охлажденной до температуры 42,5 ± 2,5 ^оС агаризованной питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре (37 ± 1) ^оС в течение необходимого для данного микроорганизма времени.

Учет результатов

По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.

Пример расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца:

– из разведения 10^-7 выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42+45) : 2 = 43,5;

– из разведения 10^-6 выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410+450) : 2 = 430;

– количество живых бактерий в 1 дозе равно:

(43,5 ∙  10⁷ + 430 ∙ 10⁶ )  : 2  10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10⁹.

Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.

2. Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды

   • Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9  (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10^-6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10^-6 в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре (38 ± 1) ⁰С в течение 3–4 сут.

По окончании инкубации определяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.

Учет результатов

При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (табл. 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения 10^-6).

Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения 10^-7 и в 1 пробирке разведения 10^-8).

Числовая характеристика результата будет 211.

По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере – 10^-6). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 13 ∙ 10⁶ = 1,3 ∙ 10⁷.

Таблица 1 – Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий

Числовая характеристика	Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки
200	2,5
201	5,0
202	–
210	6,0
211	13,0
212	20,0
220	25,0
221	70,0

2.2. Пробирочный метод учета колоний в полужидкой среде

Из разведений препарата 10^-6,10^-7,10^-8,10^-9,10^-10 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10^-6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10^-6 в питательной полужидкой среде.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) ^оС в зависимости от вида микроорганизма в течение 1–6 сут. По окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост типичных колоний для данного вида микроорганизмов.

Учет результатов

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в полужидкой питательной среде должно наблюдаться 10-кратное уменьшение количества колоний микроорганизмов.

Количество живых бактерий в дозе испытуемого препарата вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке (объем вносимого материала в 1,0 мл дает коэффициент умножения 1, который не влияет на конечный результат при вычислении).

3. Определение количества живых бактерий в поликомпонентных пробиотиках

3.1 Комбинированный метод (определение количества бифидо- и колибактерий) 

Для определения количества живых бактерий в составе препарата пробиотика из соответствующих последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9 % растворе натрия хлорида (с 10^-1  по 10^-9) проводят высевы на среду Блаурокка с натрия азидом (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий).

Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений 10^-6,10^-7,10^-8,10^-9 высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая  разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение 10^-6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10^-6 в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре (38 ± 1) ^оС в течение 4 – 5 сут.

Для определения количества кишечных палочек делают посев по 0,1 мл микробной суспензии из разведений испытуемого образца 10^-5, 10^-6 на чашки Петри со средой Эндо (по 2 чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 ± 1) ^оС в течение 18–24 ч.

Учет результатов

В среде Блаурокка с натрия азидом по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде «гвоздиков». Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке.

На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример для расчета аналогичен описанному в подразделе 1.

Раздел 2. Активность кислотообразования

Кислотообразующую активность штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков для медицинского применения определяют по титруемой кислотности при культивировании бактерий в адекватной питательной среде. Испытание количественного определения кислотообразующей активности проводят методом кислотно-основного титрования.

Для выращивания бифидобактерий используют полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, для лактобактерий – МРС-1 или стерильное обезжиренное молоко, если нет других указаний в нормативной документации.

Реактивы, используемые в испытании:

• титрованный 0,1 М раствор натрия гидроксида;
• индикатор – 1% раствор фенолфталеин.

Особенности отбора и подготовки образцов для анализа

От каждой испытуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, методом случайной выборки отбирают по 2 образца. В случае, если испытуемый образец (т.е. таблетка/капсула/суппозиторий) содержит 1 дозу, то в 1 образец объединяют 3 таблетки/капсулы/суппозитория.

Испытания проводят, соблюдая правила асептики.

Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):

1. Лиофилизаты – испытуемый образец (каждый образец в отдельности) разводят стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу препарата и перемешивают пипеткой 8–10 раз.

По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38±1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

2. Таблетки – каждый образец в отдельности предварительно растирают (асептически) в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8–10 раз.

По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

3. Порошки – содержимое саше асептично пересыпают в пробирку, вместимостью 50 мл, содержащую 25 мл питательной среды, и перемешивают. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
4. Капсулы – каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 20–30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
5. Суппозитории – каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды, адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 20–30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации определяются видом микроорганизма).

Примечание.

После окончания инкубации суспензию в пробирках освобождают от липофильной суппозиторной основы одним из следующих способов:

• сразу после окончания инкубирования при температуре посевов (38 ± 1) ^оС стерильной пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира;
• пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8 ^оС в течение (20±5)мин, затем застывшую суппозиторную основу снимают асептически пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.

Методика испытания

Уровень кислотообразования определяют в каждом из 2 образцов.

После окончания инкубации содержимое пробирки перемешивают отдельной пипеткой 8–10 раз. Каждую пробу в объеме 10 мл вносят в отдельную коническую колбу или стакан вместимостью 100 мл.

Штаммы-продуценты, выращенные в стерильном обезжиренном молоке, образуют сгусток. Образовавшийся сгусток разбивают путем тщательного перемешивания (10-12 раз) пипеткой вместимостью 10 мл. После этого 10 мл микробной суспензии переносят из пробирки с культуральной средой в коническую колбу вместимостью 100 мл, содержащую 20 мл воды очищенной. Колбу интенсивно встряхивают для равномерного перемешивания содержимого, затем прибавляют 2–3 капли 1% раствора фенолфталеина.

Полученную суспензию титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления стойкого слабо-розового окрашивания и достижения рН (8,5±0,1) (контролируют потенциометрически), при этом учитывают количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование.

Учет результатов

Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле: 

^оТ = А ∙ К ∙10,

где: А – количество миллилитров 0,1М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой микробной суспензии;

К – поправка к титру 0,1 М раствора натрия гидроксида;

10 – объем микробной суспензии, мл.

Пример расчета: на титрование 10 мл микробной суспензии пошло 10,6 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, где К = 1,03, тогда:

Т = 10,6 ∙ 1,03 ∙ 10 = 109,18  ^оТ

Вычисляют средний показатель из 2 параллельных проб от каждого образца (пробирки) и средний показатель из 2 образцов (пробирок) при условии, если показатель активности кислотообразования каждого из них был не ниже регламентированного.

Раздел 3. Антагонистическая активность

Антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов оценивают как у штаммов-продуцентов, так и у препаратов пробиотиков, полученных на их основе. Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, проводят с помощью метода отсроченного антагонизма.

При проведении испытания применяют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в нормативной документации):

• для лактобактерий и бифидобактерий – среду МРС-5;
• для кишечной палочки и споровых пробиотиков – среду Гаузе № 2.

Тест-штаммы микроорганизмов

Тест-штаммы микроорганизмов, используемые в испытании, приведены в табл. 2. Их получают в лиофилизированном виде (в ампулах) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» (если нет других указаний в нормативной документации) с сертификатом соответствия (паспортом на штамм).

Таблица 2 – Тест-штаммы микроорганизмов, используемых в испытаниях по отсроченному антагонизму

Тест-штамм микроорганизма	Номер штамма
Staphylococcus aureus	ATCC 6538 (FDA 209Р)
Escherichia coli	О157
Shigella flexneri	170, 337
Shigella sonnei	5063
Proteus mirabilis	H-237 или  56/10
Proteus vulgaris	177 или  401
Candida albicans	ATCC10231

Восстановление лиофилизированных тест-штаммов микроорганизмов

Ампулы с тест-культурами микроорганизмов вскрывают в асептических условиях в соответствии с инструкцией производителя.

Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в  стандартных условиях.

Температура инкубации посевов бактерий (32,5 ± 2,5) ^оС, грибов – (22,5 ± 2,5) ^оС, если нет других указаний в нормативной документации.

По окончании инкубации изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, изучают биохимические свойства с использованием тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами в соответствии с представленным сертификатом коллекции.

Тест-штаммы микроорганизмов в лиофилизированном виде хранятся при температуре (6 ± 2) ^оС в течение 24 мес.

Допускается не более 5 пассажей от исходной культуры.

Приготовление тест-штаммов микроорганизмов для испытания

Для испытания используют культуры, выращенные в течение (22 ± 2) ч, второго или третьего пассажа, которые инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую чистую культуру смывают 0,9 % раствором натрия хлорида с поверхности плотной питательной среды. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). Доводят концентрацию микробных клеток в полученной суспензии в соответствии со стандартным образцом мутности 5 ОЕ в соответствии с ОФС «Определение концентрации микробных клеток».

Отбор и подготовка образцов для анализа

Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях.

Пробиотические производственные штаммы-продуценты (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее 10⁷ микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат стерильный

0,9 % раствор натрия хлорида.

Особенности подготовки испытуемого

Особенности подготовки испытуемого образца препарата пробиотиков в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):

1. Лиофилизаты – разводят стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8–10 раз.
2. Таблетки – предварительно растирают в ступке (асептически) до гомогенного состояния дробно добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8–10 раз.
3. Порошки – содержимое пакета (саше) высыпают в пробирку, содержащую 25 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида, и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин.
4. Капсулы – содержимое капсулы вносят в пробирку, добавляют 1 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида и перемешивают до гомогенного состояния.
5. Суппозитории – вносят в пробирку, добавляют до общего объема 10 мл стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида, предварительно нагретый до температуры (37 + 1) ^оС. Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 10–30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния и освобождают от жировой основы (как описано выше в разделе 2).

Методика испытания

Полученную суспензию испытуемого образца перемешивают и высевают бактериологической петлей диаметром (3,5+0,5) мм на 6 чашек Петри с питательной средой, проводя по 2 параллельных штриха длиной, равной диаметру чашки.

После инкубирования в течение 48–96 ч при температуре (37 + 1) ^оС в адекватных (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) условиях в зависимости от вида микроорганизма к выросшей культуре испытуемого образца подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями нормативной документации). Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром (1,75 + 0,25) мм в направлении, перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, и не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре (37 + 1) ^оС в течение 18–20 ч (если нет других указаний в нормативной документации).

Контролем роста тест-штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.

Учет результатов

Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма.

Если нет других указаний в нормативной документации, антагонистическую активность штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, считают высокой, если:

• зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 20 мм – для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики;
• зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 15 мм – для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидосодержащие пробиотики.
• зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 10 мм – для штаммов-продуцентов, входящих в споросодержащие пробиотики

Скачать в PDF ОФС.1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков