Глава 4. Валидация методов обеспечения вирусной безопасности: разработка, проведение и интерпретация результатов исследований по валидации методов инактивации и удаления вирусов

1. Введение

1.1 В настоящей главе рассматривается необходимость проведения и влияния валидационных исследований на вирусы на обеспечение вирусной безопасности биологических препаратов. Основными целями настоящей главы являются представление рекомендаций по планированию валидационного исследования, включая выбор используемых вирусов, и интерпретация полученных данных, особенно в отношении определения этапа процесса, который можно считать эффективным для инактивации и (или) элиминации вирусов.

1.2 В настоящей главе рассматривается валидация процедур инактивации и (или) элиминации вирусов из всех категорий биологических лекарственных препаратов для медицинского применения, за исключением живых вирусных вакцин (в том числе генно-инженерных живых векторов). Виды рассматриваемых препаратов:

• препараты, получаемые при культивировании in vitro клеточных линий человеческого или животного происхождения;
• препараты, получаемые при культивировании in vivo или из органов и тканей человека или животных;
• препараты, полученные из крови или мочи, или других биологических жидкостей человека или животных.

1.3 Риск вирусной контаминации характерен для всех биологических препаратов, производство которых предполагает использование материала животного или человеческого происхождения. Вирусная контаминация биологического препарата может быть обусловлена исходным материалом, например, банками клеток животного происхождения, кровью человека, тканями человека или животных, посторонние агенты могут быть привнесены в процесс производства, например, при использовании сыворотки животных при культивировании клеток.

1.4 Основной причиной передачи вирусов, предусмотренной пунктом 1.3 настоящей главы, является контаминация исходных материалов. Контаминация биологического препарата может также происходить при использовании инфицированного материала в процессе производства или с вспомогательным веществом. В некоторых случаях вирус может быть обнаружен спустя годы после ввода препарата в обращение, поскольку контаминация произошла до получения достаточных знаний о наличии инфекционных агентов (вакцина для профилактики желтой лихорадки, может быть контаминирована вирусом лейкоза птиц, который естественным образом инфицирует куриные яйца, и вирусом гепатита В, содержащимся в сыворотке человека, использованной в качестве стабилизатора, вирус SV40 может контаминировать вакцины для профилактики полиомиелита и аденовирусной инфекции, производимые на первичных культурах клеток почек, взятых от макак-резусов, которые являются естественным резервуаром вируса SV40). Кроме того, вирусы, содержащиеся в плазме человека, например, ВИЧ и вирус гепатита C, могут контаминировать препараты крови.

1.5 В целях контроля потенциальной вирусной контаминации биологических лекарственных препаратов можно использовать три основных взаимодополняющих подхода:

• отбор и испытание исходных материалов на предмет отсутствия обнаруживаемых вирусов;
• испытание способности производственных процессов элиминировать или инактивировать вирусы;
• испытание препарата на соответствующих этапах производства на предмет отсутствия обнаруживаемых вирусов.

Ни один из подходов сам по себе не дает достаточной гарантии, поэтому в целях ее достижения необходимо использовать их комбинацию.

1.6 Испытание исходных материалов является обязательным условием минимизации вирусной контаминации. Испытания могут обнаруживать один или более видов вирусов, однако ни одно отдельное испытание не способно подтвердить присутствие всех известных вирусов. Более того, в целях получения положительного результата любые аналитические системы требуют некоторой минимальной вирусной контаминации, испытания также ограничены статистическими погрешностями при отборе проб. Некоторые испытания, например, на антитела к вирусному гепатиту C в плазме человека, способны измерять маркеры инфекции, которые появляются спустя некоторое время после инфицирования. Аналогичные соображения справедливы и в отношении испытания лекарственного препарата.

1.7 В связи с этим подтверждение отсутствия в биологическом лекарственном препарате инфекционных вирусов во многих случаях происходит не только за счет прямого испытания на их наличие, но также путем подтверждения того, что процесс производства способен элиминировать или инактивировать их. Валидация процесса инактивации и (или) элиминации вирусов может играть ключевую роль в установлении безопасности биологических препаратов, особенно при высокой вероятности контаминации исходного материала и сырья патогенными для человека вирусами,                 например, препаратов, полученных из плазмы. Кроме того, поскольку во многих случаях в прошлом происходила контаминация агентами, о которой не было известно, и даже отсутствовали подозрения о такой возможности на момент производства, оценка процесса производства может дать определенную уверенность в том, что широкий спектр вирусов (включая неизвестные опасные вирусы) подвергается элиминации.

1.8 Целью настоящей главы является описание общих принципов проведения валидационных исследований и вирусологического подхода, который необходимо использовать при планировании валидационных исследований на вирусную нагрузку. Производители должны использовать правила, содержащиеся в настоящей главе, в отношении конкретного препарата с учетом свойств исходного материала и сырья, используемых при производстве и в процедурах очистки, а также любых других факторов, которые могут влиять на этот аспект безопасности. Производители должны объяснить и обосновать подход, использованный ими в исследованиях по оценке элиминации вирусов, в регистрационном досье.

2. Источники вирусной контаминации

Вирусная контаминация биологических препаратов может быть обусловлена следующим.

2.1 Исходный материал и сырье могут быть контаминированы вирусами, инфицирующими вид животных, являющийся источником материала или сырья. Кровь может содержать различные вирусы, и применение препаратов, полученных из плазмы человека, приводило к инфицированию вирусами гепатитов B и C, ВИЧ, парвовирусом B19 и иногда вирусом гепатита A. Мышиные вирусы, некоторые из которых патогенны для человека, могут контаминировать мышиные гибридомы. Клеточные линии, предназначенные для осуществления генетической манипуляции, могут быть контаминированы вирусами, в связи с чем необходимо внимательно подходить к их выбору и проводить испытания на предмет отсутствия обнаруживаемых посторонних агентов еще до генетической манипуляции, чтобы начать работу с должным образом охарактеризованной клеточной линией.

2.2 Клетки могут быть источником латентной или персистирующей инфекции, например, вируса герпеса или ретровируса, которые могут передаваться вертикально от одного поколения клеток к следующему в виде вирусного генома и которые могутт периодически экспрессироваться в качестве инфекционного вируса.

2.3 При создании производственной клеточной линии может быть привнесен контаминирующий вирус, характерный для других видов животных, например, трансформированная вирусом Эпштейна-Барр лимфобластоидная клеточная линия человека, секретирующая моноклональные антитела, может быть инфицирована мышиным ретровирусом после слияния с клетками миеломы мышей.

2.4 Посторонние вирусы могут быть привнесены при использовании в процессе производства контаминированных животных продуктов, например, клеточные культуры могут быть контаминированы бычьими вирусами вследствие использования бычьей сыворотки, или мышиные моноклональные антитела, используемые в аффинной хроматографии, могут контаминировать препарат вирусами мышей.

2.5 Возможны иные источники контаминации, например, производственный персонал или сырье небиологического происхождения.

3. Процесс валидации

3.1 Цель валидационных исследований по очистке от вирусов заключается в:

• подтверждении того, что процесс производства эффективно инактивирует и (или) элиминирует вирусы, которые известны своей способностью контаминировать исходные материалы и сырье, или вирусы, которые, предположительно, обладают такими свойствами;
• непрямом подтверждении того, что процесс производства способен инактивировать и (или) элиминировать новые или непредвиденные вирусы.

Это достигается за счет преднамеренного добавления (spiking) вируса к материалу, находящемуся на различных этапах производства, и измерения степени его элиминации или инактивации в ходе последующих этапов. Этот подход позволяет определить этапы производства, которые эффективны в обеспечении снижения содержания инфекционного вируса; он характеризует общую способность процесса элиминировать инфекционность контаминирующих вирусов.

3.2 Валидационные исследования на вирусы, подобно прямому испытанию материалов на соответствующих этапах, влияют на обеспечение вирусологической безопасности препарата. Вместе с тем, все валидационные исследования на вирусы следует рассматривать как некоторую приближенную оценку истинных возможностей процесса, поскольку проведение идеального валидационного исследования процесса производства может оказаться затруднительным в связи с вовлечением большого числа сложных переменных. Результаты свидетельствуют о том, что даже незначительные модификации в процедуре или определенном лабораторном штамме используемого вируса могут оказывать большое влияние на элиминацию и инактивацию вирусов.

3.3 Если исходный материал или сырье недостаточно охарактеризованы, например, кровь, ткани и органы человека или животных, или если культивирование клеток осуществлялось в условиях in vivo, повышается вероятность вирусной контаминации, поэтому процесс производства, как правило, должен включать в себя один или несколько эффективных этапов инактивации и (или) элиминации вирусов. Препараты, полученные из плазмы, вызывают особые опасения в отношении вирусной безопасности.

3.4 Допускается что, если исходный материал (например, полностью охарактеризованный банк клеток) представляет меньший вирусологический риск, процесс очистки, как правило, не включает специальный этап инактивации и (или) элиминации вирусов, и считается, что валидированный процесс очистки обеспечивал достаточную степень инактивации и (или) элиминации вирусов.

Имеющийся клинический опыт не обнаружил какие-либо недостатки этого подхода. Тем не менее некоторые производители моноклональных антител (МкАТ) используют специальные этапы инактивации и (или) элиминации вирусов в процессе производства, поскольку клеточные линии-продуценты МкАТ мышиного происхождения выделяют различное количество потенциально инфекционных ретровирусов.

3.5 Следует помнить, что системам культур клеток присуще поддержание репликации вирусов. В связи с этим, несмотря на то, что банк клеток хорошо охарактеризован, сохраняется риск вирусной контаминации культуры, имеются сообщения о единичных случаях контаминации посторонними вирусами.

3.6 Обоснование проведения требуемых валидационных исследований и их объем зависят от процесса производства и типа препарата (например, вида животных, являющихся источником исходного материала, степени вариабельности исходного материала и сырья, стабильности активного продукта и т. д.). Достаточность исследований будет определяться в индивидуальном порядке.

4. Выбор вирусов для валидации

4.1 Вирусы для валидации должны, во-первых, быть как можно ближе по своей природе к вирусам, которые могут контаминировать препарат, а во-вторых, обладать как можно более широким диапазоном физико-химических свойств, чтобы определить способность системы элиминировать вирусы в целом.

4.2 В большинстве валидационных исследований используются штаммы вирусов, которые легко получить и количественно определить. Различные лабораторные штаммы вирусов могут обладать отличными друг от друга, а также от естественно встречающихся вирусов свойствами. Следовательно, любой вирус, использованный в валидационном исследовании, является фактически «модельным» вирусом. Производитель должен обосновать       выбор вирусов в соответствии с целями валидационного исследованиями и принципами, указанными в настоящей главе. В случае если два сходных вируса можно использовать для валидационых исследований из-за их большого сходства с возможными контаминантами либо из-за сходства их свойств, следует использовать более резистентный вирус, если не обосновано иное.

4.3 Примеры выбора вирусов.

Концентраты факторов свертывания, полученные из плазмы человека, подвергались контаминации ВИЧ. В связи с этим производство подобных материалов необходимо оценить на способность процесса очистки от вирусов инактивировать и (или) элиминировать инфекционный ВИЧ.

Клеточные линии, полученные от грызунов, как правило, содержат эндогенные ретровирусные частицы, которые могут быть инфекционными (частицы C-типа) или неинфекционными (частицы A-типа). Если исходный материал или сырье получают из клеточных линий грызунов, процесс производства необходимо оценить на его способность инактивировать и (или) элиминировать один из близкородственных лабораторных ретровирусов мышей.

Примерами вирусов, обладающих широким диапазоном физико­химических свойств, использованных для оценки общей способности процесса элиминировать вирусную инфекционность, являются:

• SV40, полиовирус и парвовирус животных – в качестве небольших безоболочечных вирусов;
• парагрипп или мышиный ретровирус – в качестве крупных оболочечных РНК-вирусов;
• герпесвирус – в качестве крупного ДНК-вируса.

Примеры вирусов, использованных в прошедших валидационных исследованиях, приведены в таблице.

Таблица

Примеры вирусов, использованных в валидационных исследованиях на вирусы

Вирус	Семейство	Род	Естественный хозяин	Геном	Оболочка	Размер (нм)	Форма	Резистентность к физико­химическойобработке
Вирус везику­лярного стоматита	рабдовирусы	везикуловирус	лошадь, корова	РНК	да	70×150	пуля	низкая
Вирус парагриппа	парамиксовиру сы	парамиксовирус	различные	РНК	да	100 – 200	плеосфера	низкая
Вирус иммуно­дефицита человека	ретровирусы	лентивирус	человек	РНК	да	80 – 100	сферическая	низкая
Вирус лейкоза мышей	ретровирусы	онковирус с типа	мышь	РНК	да	80 – 110	сферическая	низкая
Вирус Синдбис	тогавирусы	альфавирус	человек?	РНК	да	60 – 70	сферическая	низкая
Вирус бычьей вирусной диареи	тогавирусы	пестивирус	корова	РНК	да	50 – 70	плеосфера	низкая
Вирус псевдо­бешенства	герпесвирусы	варицелловирус	свинья	ДНК	да	120 -200	сферическая	средняя
Вирус полио­миелита 1 типа	пикорнавирусы	энтеровирус	человек	РНК	нет	25 – 30	икосаэдричес кая	средняя
Вирус энцефало­ миокардита	пикорнавирусы	кардиовирус	мышь	РНК	нет	25 – 30	икосаэдричес кая	средняя

Реовирус 3	реовирусы	ортореовирус	различные	РНК	нет	60 – 80	сферическая	средняя
Гепатит A	пикорнавирусы	гепатовирус	человек	РНК	нет	25 – 30	икосаэдричес кая икосаэдричес кая	высокая
SV40	паповавирусы	полиомавирус	обезьяна	ДНК	нет	40 – 50		очень высокая
Парвовирусы (собак, свиней)	парвовирусы	парвовирус	собака, свинья	ДНК	нет	18 – 24	икосаэдричес кая	очень высокая

Данная таблица содержит неполный перечень вирусов, использованных в валидационных исследованиях. Следовательно, необязательно использовать вирусы, указанные в таблице. Производителям рекомендуется использовать и другие вирусы, особенно если они более пригодны для конкретных производственных процессов.

4.4 Необходимо располагать эффективным, чувствительным и надежным методом количественного определения инфекционности использованных вирусов. Предпочтительно использовать вирусы, которые можно получить в высоком титре, однако это не всегда достижимо.

4.5 Препараты, получаемые из овечьих, козьих и бычьих тканей, могут быть контаминированы такими агентами трансмиссивной губчатой энцефалопатии, как скрейпи, которые накапливаются в центральной нервной системе и лимфоидной ткани. Указания по этим агентам приведены в фармакопее Союза, утверждаемой Комиссией, и отдельной главе настоящих Правил.

5. Дизайн валидационных исследований

5.1 Валидационные исследования предполагают намеренное добавление вирусов на различных этапах производства и измерение степени его элиминации (инактивации) в ходе последующего специального этапа или этапов производства. Необязательно валидировать каждый отдельный этап процесса производства. Предметом валидационного исследования необходимо сделать лишь те этапы, которые, вероятнее всего, вносят вклад в инактивацию (элиминацию) вируса.

5.2 Правила надлежащей производственной практики Союза, утверждаемые Комиссией, не допускают намеренное привнесение какого-либо вируса в производственные технологические линии. В связи с этим валидацию необходимо проводить на отдельном лабораторном оборудовании, предназначенном для вирусологической работы, на разукрупненной (уменьшенной) версии технологической линии, ей должен заниматься персонал, обладающий опытом работы по вирусологии  и промышленной  биоинженерии. Исследования необходимо проводить в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики Союза, утверждаемыми Комиссией.

5.3 В целях оценки вирусной безопасности препарата обязательным условием приемки результатов, полученных на разукрупненной системе, является сопоставимость модельных и полномасштабных процедур. В связи с этим необходимо путем сравнения таких параметров процесса, как pH, температура, концентрация белка и других компонентов, время реакции, высота колонки (column bed height), линейная скорость потока, отношение скорости потока к высоте (bed height), профиль элюирования и эффективность этапа (например, выход, баланс, специфическая активность, состав), подтвердить валидность разукрупнения. Необходимо проанализировать неизбежные отклонения с точки зрения их потенциального влияния на результаты.

5.4 По возможности необходимо показать, за счет какого процесса достигается снижение вирусной инфекционности (инактивации вируса или элиминации вирусных частиц). Этого можно достичь посредством определения кинетики снижения и (или) баланса вирусной нагрузки, исходя из обстоятельств. Процесс, снижающий вирусную инфекционность, потенциально легче поддается моделированию, чем процессы, обеспечивающие элиминацию частиц. Необходимо изучить кинетику инактивации этапа инактивации вирусов и описать ее в отчетах в табличном и графическом формате. Если слишком быстрая инактивация не позволяет отразить кинетику вирусной нагрузки с помощью описания и регистрации условий процесса, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы       доказать, что инфекционность действительно снижается за счет инактивации. Таким образом, необходимо внедрить надлежащие контроли, направленные на обнаружение возможного искажающего влияния образца или матрицы, в которую привнесен вирус, на методику количественного определения с установлением пределов обнаружения.

5.5 Необходимо изучить производственные параметры, влияющие на эффективность инактивации (элиминации) вирусов с помощью данного этапа производства, и привести результаты, использованные для установления надлежащих внутрипроизводственных пределов содержания вирусной нагрузки. К критическим параметрам относятся:

• такие механические параметры, как скорость потока, скорость перемешивания, размеры колонок, повторное использование колонок и т. д.;
• такие физико-химические параметры, как содержание белка, pH, температура, содержание влаги и т. д.

5.6 Антитела, содержащиеся в исходном материале, могут влиять на поведение вируса на этапах разделения и инактивации. В валидационных исследованиях необходимо учесть данное обстоятельство.

5.7 Валидность достигаемого лог-снижения вирусной нагрузки определяется влиянием вариации критических параметров процесса, использованных для установления внутрипроизводственных пределов.

5.8 Опубликованные работы по способности схожих или таких же процессов инактивировать (элиминировать) вирусы могут позволить выявить наиболее эффективные этапы. Однако присущая валидационным исследованиям и обусловленная необходимостью моделирования процесса, выбора используемых вирусов и определения параметров полномасштабного производства в лабораторном масштабе вариабельность означает, что данные о валидации должны основываться на экспериментальных исследованиях, представленных самим заявителем.

5.9 Количество добавляемого в исходный материал вируса на производственном этапе, подлежащем изучению, должно быть как можно большим, чтобы определить способность производственного этапа должным образом инактивировать (элиминировать) вирусы. Однако количество добавляемого вируса не должно существенно нарушать состав производимого материала (количество добавляемого вируса обычно составляет менее 10 %). По возможности вычисленные факторы снижения вирусной нагрузки должны основываться на количестве вируса, которое можно обнаружить в исходном материале после добавления к нему вируса, а не на количестве исходного добавленного в материал вируса.

5.10 По возможности вирус из образцов, взятых из модельных экспериментов, следует титровать без дальнейших манипуляций, таких как ультрафильтрация. Если дальнейшая обработка неизбежна (например, удаление ингибиторов или токсических веществ) или предполагается хранение, направленное на обеспечение одновременного титрования всех образцов, необходимо включить надлежащие контроли с целью определения, какое влияние оказывают эти процедуры на результат исследования. Влияние образца на систему обнаружения, включая токсические эффекты, необходимо документировать, поскольку образцы влияют на пределы обнаружения.

5.11 Количественное определение инфекционности необходимо проводить в соответствии с принципами, определенными правилами надлежащей лабораторной практики Союза, утверждаемыми Комиссией, они могут включать бляшкообразование, обнаружение других цитопатических эффектов, таких как образование синцития или очагов, титрование по конечным точкам (например, методики определения TCID50), обнаружение синтеза вирусных антигенов и другие методы. С целью обеспечения надлежащей статистической правильности результата метод должен обладать достаточной чувствительностью и воспроизводимостью и проводиться с достаточным количеством повторов и контролями в соответствии с приложением № 1 к настоящей главе.

5.12 Методы амплификации нуклеиновых кислот (например, ПЦР) являются подходом, обладающим большой чувствительностью для выявления вирусных геномов, они способны обнаруживать такие вирусы, как гепатит B и C, которые не растут на культурах клеток. Однако важным ограничением этой технологии является обнаружение инактивированного вируса в методике амплификации генома, что может занижать степень вирусной инактивации, достигнутой с помощью потенциально эффективного процесса. ПЦР обладает высокой чувствительностью в исследованиях процессов, зависящих от элиминации вирусов. Основными затруднениями при использовании этой технологии являются квантификация, стандартизация, контроль качества и интерпретация результатов. Необходимо однозначно валидировать и стандартизировать методики ПЦР перед внедрением их в процесс валидации, необходимо проявлять предельную осторожность при интерпретации как положительных, так и отрицательных результатов.

5.13 Необходимо обеспечить надлежащее уничтожение любого вируса, который потенциально мог задержаться в системе, перед повторным использованием данной системы (например, путем очистки колонок и т. д.).

6. Интерпретация данных

6.1 При определении эффективности этапа инактивации (элиминации) вирусов необходимо учитывать комбинацию факторов. Оценка этапа исключительно на основании количества инактивированного (элиминированного) вируса может стать причиной ошибочного заключения о том, что процесс, обеспечивающий определенную степень снижения содержания вирусов, будет приводить к получению безопасного препарата. Следующие факторы влияют на эффективность этапа инактивации (элиминации) вирусов, поэтому в каждом случае их необходимо тщательно оценивать:

• правильность использованных испытуемых вирусов в соответствии с разделом 4 настоящей главы;
• дизайн валидационных исследований в соответствии с разделом 5 настоящей главы;
• достигнутое значение снижения вирусной нагрузки (lg). Факторы снижения вирусной нагрузки, равные или превышающие 4,0 lg, свидетельствуют об однозначном влиянии на конкретный исследуемый испытуемый вирус. Вместе с тем следует отметить, что численное значение фактора снижения вирусной нагрузки нельзя использовать в качестве единственной, абсолютной меры эффективности этапа;
• кинетику инактивации, которая указывает, является ли измеренный лог-фактор снижения консервативной (стабильной) оценкой. Инактивация вирусов, как правило, не является простой реакцией первого порядка, она обычно состоит из быстрой начальной фазы с последующей медленной фазой. Существенное снижение скорости инактивации со временем может свидетельствовать о снижении эффективности инактивирующего агента или о том, что остаточное содержание вирусов устойчиво к инактивирующему агенту, а это значит, что этап не является ни высокоэффективным, ни устойчивым;
• характер инактивации (элиминации) и ее селективность в отношении лишь определенных классов вирусов. Этап процесса инактивации (элиминации) вирусов может быть высокоэффективен в отношении одних вирусов и неэффективен в отношении других (например, обработка Р/Д эффективна против оболочечных, но не безоболочечных вирусов);
• подверженность процесса инактивации (элиминации) вирусов небольшим вариациям параметров будет влиять на степень пригодности этапа;
• пределы чувствительности методик количественного определения.

На основании совокупной оценки вышеперечисленных факторов принимается решение об отнесении этапа к эффективному, умеренно эффективному или неэффективному по способности к инактивации (элиминации) вирусов.

6.2 Частные варианты интерпретации данных по эффективности отдельного этапа процесса инактивации (элиминации) вирусов определяются следующими условиями:

• если на этап процесса привнесено 6,0 lg вируса и из внесенного количества обнаружено 4,0 lg вируса, этап нельзя признать эффективным, хотя он и может вносить вклад в общую элиминацию;
• если на этап процесса привнесено 6,0 lg вируса, однако вследствие цитотоксичности препарата предел чувствительности методики в препарате составляет 4,0 lg вируса, подтверждается лишь элиминация lg вируса, а этап не признается эффективным. Этап процесса фактически способен элиминировать большее количество вируса, что можно подтвердить с помощью другого дизайна эксперимента;
• если на этап процесса привнесено 6,0 lg вируса и из внесенного количества обнаружено 2,0 lg вируса, элиминировано значительное количество вируса. Препарат не является вирусологически стерильным. Однако если такое снижение содержания вирусов воспроизводимо и на него не влияют переменные процесса, процесс обладает определенной эффективностью. Он вносит вклад в совокупное снижение вирусной нагрузки и может признаваться в качестве процесса, снижающего вирусную нагрузку.
• если на этап процесса привнесено 6,0 lg вируса и вирус не обнаруживается в препарате с пределом чувствительности, равным lg вируса, подтверждена элиминация приблизительно 4,0 lg вируса. Этот показатель является значимым, а процесс фактически способен гарантированно элиминировать гораздо большее количество вируса, чем можно определить при количественном исследовании или заявить в спецификации;
• если вирус подвергается инактивации, важна кинетика снижения инфекционности. Если этап процесса предполагает продолжительную инкубацию (например, нагревание в течение десяти часов), а инфекционность быстро достигает пределов обнаружения, процесс, вероятнее всего, обладает большим, чем зачастую можно подтвердить, вирулицидным эффектом. Однако если инфекционность снижается медленно, а пределы обнаружения достигаются к концу обработки, этап дает меньшую гарантию вирусной безопасности.

6.3 Процессы разделения в целом не являются эффективными этапами элиминации вирусов, однако они могут вносить вклад в их элиминацию. Процессы разделения, как правило, обладают рядом переменных, которые сложно поддаются контролю и разукрупненению для валидационных целей. Разделение зависит от крайне специфичных физико-химических свойств вируса, влияющих на его взаимодействие с гелевыми матрицами, и особенностей преципитации. Таким образом, разделение «модельного» вируса может полностью не соответствовать профилю разделения целевого вируса в связи с относительно небольшими различиями в таких поверхностных свойствах, как гликозилирование. Даже «релевантный» вирус, полученный в лаборатории, может проявлять в этом отношении другие свойства по сравнению с «диким» вирусом. Однако если процесс разделения дает воспроизводимое снижение вирусной нагрузки, и если параметры производства, влияющие на разделение, можно должным образом охарактеризовать и контролировать, а желаемую фракцию можно надежно отделить от предположительно содержащей вирусы фракции , тогда этот процесс может подпадать под критерии эффективного этапа.

6.4 Цель валидации заключается в выявлении эффективных этапов инактивации (элиминации) вирусов и получении оценки общей способности процесса производства инактивировать (элиминировать) их. Совокупный фактор снижения вирусной нагрузки, как правило, выражается суммой отдельных факторов в соответствии с приложением № 2 к настоящей главе. Простое суммирование малых факторов снижения, получаемых на каждом этапе, может вводить в заблуждение. Снижение вирусного титра на 1,0 lg и менее является ненадежным вследствие имеющихся ограничений валидационных исследований на очистку от вирусов, поэтому все факторы с такой величиной снижения вирусного титра следует игнорировать. Производители должны дифференцировать эффективные этапы от этапов процесса, которые могут вносить вклад в элиминацию, но обладают меньшей надежностью. Необходимо также учесть вероятность резистентности вируса, выжившего на одном этапе, к последующему этапу или, наоборот, наличия у него повышенной восприимчивости. В целом один этап, обладающий большим эффектом, дает большую гарантию вирусной безопасности, чем несколько этапов, обладающих таким же совокупным эффектом.

6.5 Если с помощью процесса производства достигается небольшое снижение вирусной нагрузки и основным фактором безопасности препарата является элиминация вируса, необходимо предусмотреть специфический дополнительный этап или этапы инактивации (элиминации).

6.6 В отношении всех вирусов производители должны обосновать приемлемость достигнутых факторов снижения вирусной нагрузки. Результаты будут рассматриваться в индивидуальном порядке.

6.7 Необходимо строго соблюдать принципы правил надлежащей производственной практики Союза, утверждаемых Комиссией, предусматривающие разграничение материала, подвергшегося эффективному этапу инактивации (элиминации) вирусов, и необработанного материала.

7. Ограничения валидационных исследований

Валидационные исследования вносят вклад в обеспечение установления приемлемого уровня безопасности лекарственного препарата, но самостоятельно не обеспечивают безопасность лекарственного препарата. Ряд факторов планирования и проведения валидационных экспериментов по очистке от вирусов может привести к некорректной оценке способности процесса элиминировать естественную вирусную инфекционность. К ним относятся перечисленные ниже факторы.

7.1 Различные лабораторные штаммы вируса могут отличаться по своей чувствительности к одному и тому же виду обработки. Таким образом, определенный выбранный в исследовании вирус может не отражать свойства того вируса, для моделирования процесса очистки от которого он выбран. Природные вирусы могут обладать непредсказуемыми свойствами, например, при взаимодействии с липидами, которое могут влиять на их свойства. Вирусные препараты, используемые в целях валидации процесса производства, чаще всего, получают на культуре тканей. Поведение вируса из тканевой культуры на производственном этапе может отличаться от поведения природного вируса, например, если природный и культивированный вирусы отличаются по чистоте или степени агрегации. Необходимо документировать штаммы вируса, их культивирование и количественное определение, а также пробоподготовку и хранение.

7.2 В некоторых случаях сложение логарифмических факторов снижения вирусной нагрузки недопустимо. Например, если матрица способна адсорбировать 10⁴ инфекционных единиц вируса и далее неспособна адсорбировать материал с сопоставимой аффинностью, будут удалены все вирусы, введенные в количестве 10⁴ инфекционных единиц, но только 1 % вирусов при введении 10⁶ инфекционных единиц. Таким образом, измеряемый клиренс будет розниться в зависимости от введенного титра.

7.3 Инактивация вирусной инфекционности зачастую представляет собой двухфазную кривую с быстрой начальной фазой и более медленной последующей фазой. Нельзя исключать, что вирус, избежавший первого этапа инактивации, будет более устойчив к последующим этапам. Как следствие совокупный фактор снижения вирусной нагрузки необязательно является суммой факторов снижения, рассчитанных на каждом этапе, на котором привносилась суспензия свежеприготовленного вируса. Например, если резистентная фракция принимает форму вирусных агрегатов, инфекционность может быть устойчива к различным видам химической обработки и нагреванию.

7.4 Обработка в модельном масштабе, как правило, будет отличаться от полномасштабной обработки, несмотря на проведение разукрупненного процесса.

7.5 Наличие антител к природному вирусу может влиять на их отделение от вирусной частицы или его чувствительность к химической инактивации, но оно также может осложнять планирование исследования за счет нейтрализации инфекционности. Определение правильности дизайна исследования может быть затруднительным. Содержание антител может являться значимой переменной процесса.

7.6. Небольшие различия в таких производственных параметрах, как содержание белка или температура, могут приводить к большим различиям в снижении вирусной инфекционности за счет различных механизмов.

8. Повторные исследования

8.1 Изменение процесса производства может потребовать проведения нового валидационного исследования.

8.2 По мере накопления теоретических знаний процессы валидации очистки будут требовать перепроверки в целях подтверждения того, что они продолжают удовлетворять приемлемому стандарту.

Приложение  № 1 Указания по статистической оценке вирусных титров и факторов снижения их содержания, а также оценке их валидности

1. Титрование вирусов подвержено вариации, что характерно для всех биологических систем количественного определения. Необходимо обеспечить правильность оценки вирусных титров и факторов снижения, полученных на их основе, а также валидность методик, чтобы определить надежность исследования. Цель статистической оценки заключается в установлении того, что исследование проведено на приемлемом уровне вирусологической компетентности.
2. Методы количественного определения могут быть квантовыми и количественными. К квантовым методам относятся методики определения инфекционности у животных и методики определения инфекционной дозы для тканевой культуры (TCID), в которых определяется число инфицированных и неинфицированных животных или клеточных культур. Титр инфекционности определяют как долю инфицированных животных или культур. В количественных методах измеренная инфекционность непрерывно варьирует в зависимости от количества введенного вируса. К количественным методам относятся методики бляшкообразования, в которых каждая бляшка соответствует одной инфекционной единице. Как квантовые, так и количественные методики подлежат статистической оценке.
3. Вариабельность методики может быть обусловлена ошибками разведения, статистическими эффектами и различиями в системе, которые неизвестны либо сложно поддаются контролю. Эти эффекты, будут более выражены при сравнении различных аналитических циклов (вариабельность между аналитическими циклами), чем при сравнении результатов одного аналитического цикла между собой (вариабельность внутри цикла).
4. 95% доверительные границы вариабельности внутри цикла и между циклами должны быть ± 0,5 lg или меньше. Вариабельность между аналитическими циклами следует контролировать путем включения собственного стандартного препарата, оценка активности которого должна находиться приблизительно в пределах ± 0,5 lg от средней оценки, установленной в лаборатории в качестве приемлемой для применяемой методики. Вариабельность внутри цикла можно определять с помощью стандартных методов, описанных в руководствах по аналитическим исследованиям. При достаточном обосновании могут быть приняты результаты любого эксперимента, даже если прецизионность титрования меньше указанных целевых значений.
5. Снижение вирусной нагрузки необходимо рассчитать на основании экспериментально установленных вирусных титров. По возможности необходимо определить 95% доверительные границы факторов снижения. Приблизительно их можно рассчитать с помощью следующей формулы:

где:

• ± s – 95% для содержания вирусов в исходном материале;
• ± a – 95% границы для содержания вирусов в материале после прохождения этапа инактивации (элиминации).

Если после этапа инактивации (элиминации) инфекционность в образце не обнаруживается, фактор снижения невозможно рассчитать статистическими методами. В целях получения оценки минимального фактора снижения титр необходимо принять равным одной инфекционной единице или менее в объеме с наибольшей испытанной концентрацией. Отсутствие признаков инфекционности в пробе будет характерно после применения мощных процессов инактивации. Чтобы максимально увеличить расчетный минимальный фактор снижения вирусной нагрузки с помощью эффективного процесса инактивации, необходимо отбирать как можно большее количество обработанного неразведенного материала.

Приложение № 2 Указания по расчету факторов снижения вирусной нагрузки

Фактор снижения вирусной нагрузки (R) отдельного этапа инактивации или элиминации задается следующей формулой:

где:

R – фактор снижения вирусной нагрузки;

V1 – объем исходного материала;

T1 – концентрация вируса в исходном материале;

V2 – объем материала после этапа инактивации (элиминации);

T2 – концентрация вируса после этапа инактивации (элиминации).

Данная формула учитывает как титр, так и объем материала до и после этапа инактивации (элиминации).

Факторы снижения, как правило, выражают в виде логарифмов, это значит, что даже при существенном снижении вирусной инфекционности она никогда не будет равна нулю. Согласно требованиям статьи (монографии) «Методы приготовления стерильных препаратов» фармакопеи Союза, утверждаемой Комиссией, в отношении методов стерилизации достаточными признаются процессы, которые обеспечивают гарантированный уровень стерильности (ГУС), равный 10^-6 или менее, в отношении бактерий, плесеней и дрожжей. ГУС, равный 10^-6, обозначает вероятность содержания не более одного жизнеспособного микроорганизма на 1*10⁶ стерилизованных единиц лекарственного препарата.