Содержание

Глава 18. Производство, качество, доклинические, клинические исследования лечебно-профилактических препаратов бактериофагов

1. Производство бактериофагов

1.1. Введение

Бактериофаги являются вирусами бактерий, их естественными врагами и регуляторами популяции. Бактериофаги чрезвычайно широко представлены в природе во всех ареалах обитания бактерий, с оценкой общей численности в биосфере до 1030 – 32 частиц. По типу взаимодействия с бактериями они различаются на умеренные и вирулентные (литические). Умеренные фаги способны к интеграции в геном бактерии в виде профага либо могут размножаться, не вызывая гибели бактерий. В медицине их используют только в диагностических целях (например, для внутривидового типирования бактерий). Вирулентные фаги, проникая внутрь бактериальной клетки, немедленно переключают ее метаболизм на воспроизведение новых фагов, которое завершается лизисом бактерии. Литический процесс повторяется с новыми и новыми бактериальными клетками. Именно вирулентные (литические) бактериофаги обладают наибольшим терапевтическим потенциалом, поскольку только они способны к уничтожению клеток бактерий-хозяев. На этом принципе основано использование фагов при лечении и профилактике гнойно-воспалительных инфекций бактериальной природы, коррекции дисбиотических состояний. Эти препараты представляют собой стерильные очищенные фильтраты фаголизатов соответствующих видов бактерий. Они освобождены от продуктов жизнедеятельности бактерий, эндо- и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальных клеток, белковых и антигенных комплексов питательных сред.

Благодаря строгой специфичности действия бактериофаги, в отличие от антибиотиков, не угнетают нормальную микрофлору макроорганизма, не подавляют его механизмы иммунной защиты и не обладают токсическим действием. На литическую активность бактериофагов не влияет наличие резистентности бактерий к антибиотикам. Главным условием клинической эффективности при назначении препаратов бактериофагов является фагочувствительность бактериального возбудителя.

Организация производства лечебно-профилактических препаратов бактериофагов, как и других иммунобиологических лекарственных средств, осуществляется согласно санитарным правилам Союза и государств-членов, с учетом требований системы обеспечения качества надлежащей производственной практики Союза. Вместе с тем имеются определенные особенности в комплектации и размещении производственных помещений.

Для работы со штаммами бактерий и фагами, выделенными из патологического материала и объектов внешней среды (почва, водоемы, сточные воды и т.д.) необходимы изолированные от производства боксированные помещения для проведения микробиологических исследований.

Обязательными начальными этапами работы являются:

выделение чистых культур перспективных штаммов бактерий (т.е. кандидатов в производственные штаммы бактерий);

выделение вирулентных бактериофагов с широким спектром антибактериальной активности для пополнения коллекции маточных фагов.

В производственной зоне должны быть предусмотрены раздельные микробиологические боксы для работы с производственными бактериальными штаммами и маточными фагами.

При производстве фаговых препаратов проводят валидацию технологического процесса, технологического оборудования, сырья и методов контроля. Все исходные материалы и сырье, используемые при производстве, должны иметь документы, подтверждающие их качество. Вспомогательные вещества, входящие в состав препаратов с лечебно-профилактическими бактериофагами, должны быть разрешены к медицинскому применению и использоваться в дозах, не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека.

Производственные питательные среды не должны содержать антибиотиков и компонентов, вызывающих аллергические или иные нежелательные реакции у человека. Питательные среды должны обладать хорошими ростовыми свойствами и быть стерильными. Сырье, реактивы и реагенты, используемые при производстве питательных сред, должны быть пригодны для соответствующих целей и их качество должно быть подтверждено документально.

1.2. Требования к производственным штаммам

Производственные штаммы бактерий – продуценты бактериофагов, которые выделяют от больных гнойно-септическими или кишечными инфекциями и получают из бактериологических диагностических лабораторий, расположенных в регионах реализации и потребления лечебно-профилактических бактериофагов. Коллекция производственных штаммов бактерий, используемых в производстве бактериофагов, должна ежегодно обновляться свежевыделенными штаммами от больных не менее чем на одну треть.

Производственные штаммы бактерий должны обладать типичными для каждого вида морфологическими, культуральными, биохимическими и серологическими свойствами, не продуцировать энтеротоксины и не содержать умеренных бактериофагов. Оценку наличия индуцируемых профагов проводят путем обработки бактерий индукторами (ультрафиолетовым излучением, митомицином C, налидиксовой кислотой) с последующим контролем появления бляшек лизиса, вызванного активацией умеренных бактериофагов, содержащихся в геноме бактерии.

Производственные штаммы бактерий должны лизироваться маточными фагами в титрах по методу Аппельмана не менее чем на 1 – 2 порядка выше показателей специфической активности конечного продукта. При этом стабильность лизиса должна сохраняться после 48 часов инкубирования при температуре 37 °C. Температурный режим и время инкубации зависят от специфических особенностей бактерий и их фагов.

Производственные штаммы бактерий хранят в специальных изолированных помещениях в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре 2 – 8 °C в течение 10 лет или в бактериологических пробирках с 0,4 – 0,7 процентной агаризованной питательной средой (на основе гидролизата Хоттингера, МПБ или других питательных сред в зависимости от специфических потребностей бактерий) под стерильным вазелиновым маслом, при температуре 2 – 8 °C и регулярном пересеве каждые 2 – 3 месяца.

В качестве контрольных бактериальных штаммов не должны использоваться производственные штаммы бактерий, используемые для наработки соответствующих бактериофагов.

Маточные бактериофаги.

Для получения фаговых препаратов используются только вирулентные бактериофаги. Их выделяют из природных источников – клинического материала, сточных вод, почвы, пассируя на штаммах целевых видов бактерий – свежевыделенных и производственных. Подбирают высокоактивные расы (штаммы) фагов к слаболизирующимся и фагорезистентным штаммам бактерий. Пополнение производственных фаговых рас различными штаммами из природных источников позволяет преодолевать первичную фагоустойчивость возбудителей. Маточные бактериофаги должны включать вирулентные фаги с широким диапазоном действия по отношению к штаммам соответствующего вида бактерий, обладать высокой активностью, стабильностью лизиса, специфической направленностью антимикробного действия и высокой урожайностью. Характеристика кандидатных фаговых рас (штаммов) при отборе может быть дополнена электронно-микроскопическим изучением их морфологии и другими современными молекулярно-биологическими методами (полногеномное секвенирование с последующим биоинформационным анализом). Хранение производственной коллекции бактериофагов осуществляется в жидком состоянии при температуре от 2 до 8 °C в течение 5 лет с ежегодным пересевом на бактериальных штаммах или в лиофилизированном состоянии.

Расширение диапазона действия препаратов в отношении циркулирующих бактериальных возбудителей может быть достигнуто путем подбора фаговых рас из коллекции предприятия или из природных источников. Это обеспечивает возможность выпуска производственных серий бактериофагов целевого назначения. Например, при вспышке или появлении очага инфекции, обусловленной фагоустойчивым возбудителем, передача на производство эпидемически значимого бактериального штамма позволит адаптировать препарат к конкретным эпидемиологическим условиям путем подбора к этому бактериальному штамму активных фаговых рас из коллекции производителя и последующего использования их при изготовлении препарата.

1.3. Основные этапы производства

Производственный процесс включает в себя: работу с бактериальными возбудителями гнойно-септических и кишечных инфекций, подбор к ним вирулентных штаммов бактериофагов, отбор бактерий – продуцентов бактериофагов, получение маточных бактериофагов, культивирование производственных штаммов бактерий – продуцентов и маточных бактериофагов с целью получения биомассы бактериофагов и приготовление препаратов бактериофагов. Освобождение фаголизитов от продуктов жизнедеятельности бактерий, эндо- и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальных клеток должно быть обеспечено дополнительными методами очистки (ультрафильтрацией, афинной хроматографией и т.д.).

После завершения процесса фаголизиса бактериальной взвеси осуществляется стерилизующая фильтрация фаголизатов, затем очищение от бактериальных метаболитов и токсинов, компонентов питательной среды, далее фаголизаты подвергаются концентрированию, полученные концентраты стерилизуются.

После концентрирования из фаголизатов готовят:

жидкие препараты, которые доводятся до финального титра буферными растворами pH 6,0 – 8,0, стерилизуют и разливают в стерильные флаконы, укупориваются герметично и стерильно;
лиофилизированную биомассу, используемую для получения таблеток, суппозиториев, мазей, линиментов и др.

1.4. Контроль качества в процессе производства

В процессе производства бактериофагов на разных этапах получают промежуточные продукты, которые должны соответствовать определенному уровню качества.

При подготовке производственных штаммов бактерий контроль посевных культур бактериальных штаммов-продуцентов включает в себя следующие показатели:

чистота;
типичность биологических свойств;
отсутствие легко индуцируемых профагов.
При подготовке маточных бактериофагов контроль маточных бактериофагов включает в себя следующие показатели:
содержание фаговых частиц в 1 мл, определяемое методом агаровых слоев по Грациа;
специфическая активность, определяемая титрованием в жидкой питательной среде по методу Аппельмана на посевных бактериальных штаммах;
стабильность лизиса (сохранность полученных результатов лизиса по методу Аппельмана) в течение 48 часов инкубации при температуре 37 ± 1 °C. Температурный режим и время инкубации зависят от специфических особенностей бактерий и их фагов;
стерильность.

По мере завершения очистки фаголизатов, концентрирования, стерилизующей фильтрации проводится определение показателей pH, стерильности, специфической активности по методу Аппельмана.

Для получения жидкого препарата после финальной стадии бактериофаг разливают по флаконам и укупоривают.

Для получения других лекарственных форм препаратов бактериофагов:

в концентрированный бактериофаг добавляют стабилизаторы и лиофилизируют. Сухую массу бактериофага контролируют в тестах на специфическую активность и микробиологическую чистоту;
после добавления наполнителей осуществляют технологические процессы, соответствующие заданной лекарственной форме (таблетки, капсулы, суппозитории, линименты, мази);
готовый продукт контролируют по всем показателям, соответствующим лекарственной форме.

К специфическим методам исследования, используемым для характеристики лечебно-профилактических бактериофагов, относятся методы Аппельмана и Грациа.

1.5. Транспортирование и хранение

Транспортирование осуществляется при температуре от 2 до 8 °C, в пределах 1 месяца – допускается при температуре от 9 до 25 °C.

Хранение в сухом, защищенном от света и недоступном для детей месте при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 – 2 лет. Однако возможно расширение температурного режима хранения до 25 °C при подтверждении активности препарата в течение заявленного срока годности.

2. Доклинические исследования лечебно-профилактических бактериофагов

Оценка возможности использования новых фаговых препаратов в лечебных целях должна проводиться с учетом современных знаний о биологии, генетике и экологии бактериальных вирусов. В отчетах по доклиническим испытаниям лечебно-профилактических препаратов бактериофагов должны быть представлены результаты изучения биологических свойств препарата (в том числе биологических свойств фаговых штаммов, включенных в его состав), результаты изучения эффективности фагового препарата при лечении экспериментальной бактериальной инфекции, безопасности (острой и хронической токсичности, аллергизирующих свойств).

2.1. Биологические свойства лечебно-профилактических бактериофагов

При конструировании препаратов используют вирулентные фаги природного происхождения. Исходной субстанцией лечебно-профилактических бактериофагов являются стерильные фильтраты фаголизатов соответствующих видов бактерий. Дополнительными методами очистки должно быть обеспечено их освобождение от продуктов жизнедеятельности бактерий, эндо- и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальных клеток. Очищенные концентрированные фаголизаты подлежат соответствующим технологическим процедурам в зависимости от вида конечного препарата (моно- или комбинированный) и его лекарственной формы. В состав препарата должны входить несколько штаммов (не менее 2 – 3) вирулентных фагов, биологические свойства каждого из них должны быть охарактеризованы.

2.1.1. Характеристика биологических свойств фаговых штаммов, включенных в состав лечебно-профилактического препарата бактериофагов.

Бактериофаги должны иметь строго литический инфекционный цикл. Наиболее полной характеристикой, позволяющей всесторонне оценить наличие генов перехода в лизогенный цикл, факторов вирулентности и токсинов, является определение полной последовательности генома бактериофага.

Экспериментальными признаками такой классификации могут служить определение морфологии вирусной частицы с помощью электронной микроскопии негативного контрастирования и ПЦР-типирование по наиболее консервативным генам, характерным для данной группы бактериофагов.

Каждый из фаговых штаммов, используемых в препарате, должен:

демонстрировать высокую специфическую литическую активность, выявляемую путем титрования в жидкой питательной среде по методу Аппельмана;

иметь высокую концентрацию (количество бляшкообразующих единиц в 1 мл), определяемую методом агаровых слоев по Грациа;

обладать широким диапазоном литического действия на представительной коллекции бактериальных штаммов, музейных и изолированных от больных;

быть изучен с помощью молекулярно-генетических методов (полногеномного секвенирования) для определения его полной нуклеотидной последовательности ДНК с последующим биоинформационным анализом;

быть морфологически охарактеризован с помощью электронной микроскопии негативного контрастирования, что позволяет соотнести de novo выделенный бактериофаг с известными группами фагов, которые заведомо относятся к литическим и пригодным для терапевтического применения.

Другими характеристиками, которые должны быть определены для каждого фагового штамма, являются:

частота генерации фагоустойчивых форм;

длительность латентного периода в ходе инфекции;

урожайность и величина выхода фаговых частиц из одной инфицированной бактериальной клетки.

Кроме того, должна быть представлена характеристика бактериального штамма, на котором проводится культивирование бактериофага. Штамм не должен содержать легко индуцируемых профагов, загрязняющих препарат. Оценку наличия индуцируемых профагов проводят путем обработки бактерий индукторами (ультрафиолетовым излучением, митомицином C, налидиксовой кислотой) с последующим контролем появления бляшек лизиса, вызванного активацией умеренных бактериофагов, содержащихся в геноме бактерии.

2.1.2. Характеристика основных биологических свойств лечебно-профилактических препаратов бактериофагов.

Представленные материалы на препарат в целом, помимо характеристик на отдельные фаги, должны содержать следующую информацию:

специфическая литическая активность, определяемая по методу Аппельмана с использованием соответствующих бактериальных тест-штаммов (контрольных штаммов). Тест-штаммы (не менее 10), типичные по своим морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, не должны быть использованы при изготовлении препарата. Активность бактериофага, определяемая по методу Аппельмана, выражается отрицательным десятичным логарифмом, указывающим последнее разведение бактериофага в жидкой питательной среде, в которой рост бактериальной культуры визуально не наблюдается;

диапазон действия изучаемого препарата в отношении соответствующих ему видов бактериальных возбудителей инфекций, выделенных от больных (не менее 70 процентов фагочувствительных штаммов), циркулирующих в современных условиях на территориях государств-членов (не менее 3-х регионов);

стабильность препарата. Активность препаратов бактериофагов должна сохраняться в течение всего заявленного срока годности при регламентированной температуре хранения. Определение стабильности препарата (способности сохранять литическую активность бактериофага) проводится по методу Аппельмана.

При проведении исследования антимикробного действия бактериофагов необходимо обеспечение следующих условий, гарантирующих достоверность результатов:

питательные среды для культивирования бактерий, на которых изучается антимикробное действие бактериофага, должны отвечать требованиям стандартности и воспроизводимости результатов;

стандартность бактериальной нагрузки (посевной дозы) штаммов-мишеней для изучаемого бактериофага.

2.2. Определение эффективности

Эффективность фаговой терапии должна быть установлена на соответствующей модели экспериментальной инфекции. Изучение защитного действия фагового препарата проводится в отношении бактериального возбудителя, против которого разработан изучаемый препарат.

Экспериментальные животные.

При изучении терапевтической эффективности используются различные виды животных: белые мыши и крысы, морские свинки, кролики. На первых этапах целесообразно использование белых мышей. В исследованиях in vivo на животных подтверждается антибактериальный эффект, выявленный в исследованиях in vitro.

Модели экспериментальной инфекции.

Наиболее распространенной моделью является генерализованная инфекция (экспериментальный сепсис) белых мышей (массой 18 – 20 г, не менее 10 особей в каждой группе). Заражающая доза для каждого вида бактерий устанавливается в предварительных опытах.

Способы заражения – внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное (последние 2 варианта – при использовании высоковирулентных возбудителей).

Выбор других моделей экспериментальной инфекции зависит от специфики возбудителя, его тропности к тем или иным системам организма. Возможно моделирование хронической септикопиемии, пневмонии, пиелонефрита, менингита и менингоэнцефалита, других локализованных инфекционных процессов.

Порядок проведения исследования.

После выявления эффективности препарата in vivo на этапе первичного скрининга проводятся исследования терапевтической эффективности по сравнению с антибактериальными препаратами (антибиотиками) той же направленности, что и изучаемый препарат. При оптимальной дозе введения определяется связь эффективности препарата с тяжестью инфекции (при различных инфицирующих дозах – 1 LD50, 2 – 4 LD50, 10 LD50, 100 LD50 и более в зависимости от возбудителя).

В зависимости от цели исследования проводится оценка:

профилактической эффективности препарата – введение препарата за 1, 3, 6, 12, 24 и 48 часов до заражения;

терапевтической эффективности препарата – введение препарата через 1, 3, 6, 12, 24 или 48 часов после заражения.

Исследования проводятся при различной кратности введения (однократно или повторно в зависимости от модели). Традиционная модель фаготерапии – внутрибрюшинное введение препарата с определенным содержанием фаговых частиц в вводимой дозе ежедневно в течение 10 – 12 суток. В процессе исследования определяют минимальную эффективную дозу с учетом предполагаемой терапевтической дозы для человека в перерасчете на килограмм массы.

Каждое отдельное исследование включает в себя 2 вида контроля:

контроль гибели животных без лечения;

контроль эффективности лечения (в сравнении с известным антимикробным препаратом – антибиотиком аналогичной направленности).

В качестве препарата сравнения можно использовать питательную среду, на которой приготовлен изучаемый препарат бактериофага.

Длительность наблюдения за животными зависит от особенности течения инфекции при конкретной нозологической форме.

Оценка эффективности.

Оценка эффективности препарата бактериофага проводится по следующим показателям:

сравнительная выживаемость и сроки гибели животных в контрольной и опытной группах;

динамика освобождения от возбудителя в контрольной и опытной группах (в процессе лечения и по его окончании проводят посев крови, органов с определением числа бактерий на 1 г);

клинические проявления (температура тела, изменение веса, состояние шерстяного покрова, поведенческие реакции);

клинико-лабораторные показатели (клинический анализ крови, показатели анализа спинномозговой жидкости и др.);

патоморфологические изменения органов и тканей в процессе лечения и по его окончании.

Результаты обрабатываются адекватными статистическими методами.

2.3. Безопасность

Препараты бактериофагов должны отвечать всем требованиям безопасности и не иметь бактериальных или иных токсических загрязнений. Современные технологии изготовления фаговых препаратов предусматривают высокую степень очистки от продуктов жизнедеятельности бактерий, эндо- и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальных клеток. Подтверждением этому могут быть исследования препаратов по определению бактериальных эндотоксинов, энтеротоксинов и др. в соответствии с особенностями изучаемого препарата.

Методы очистки препаратов должны быть подробно описаны, обоснованы и включены в отчеты по результатам доклинических исследований.

Подтверждение безопасности препаратов бактериофагов включает в себя изучение токсичности (острой и хронической), местного и аллергизирующего действия.

Исследование токсичности.

Определение токсичности фаговых препаратов проводят на белых мышах массой 18 – 20 г, каждая группа должна включать не менее 10 животных. Необходимость проведения гистологических исследований зависит от способности бактериальных штаммов, используемых при производстве бактериофагов, к токсинообразованию.

Оценка токсичности при однократном введении.

Исследование острой токсичности проводится при однократном внутрибрюшинном введении фага в дозе, многократно превышающей максимальную разовую дозу для человека в пересчете на единицу массы тела (100 – 200 раз). Максимальный объем – не более 1 мл. Срок наблюдения – не менее 7 суток после введения препарата. Животные не должны терять в весе, должны отсутствовать признаки заболевания и инфильтраты в месте введения препарата. В периферической крови опытных животных после введения бактериофага должны отсутствовать значительные изменения картины крови по сравнению с данными в контрольной группе. Необходимо проведение гистологических исследований внутренних органов животных.

Оценка токсичности при многократном введении.

Изучение токсичности при многократном введении проводится при внутрибрюшинном введении фага ежедневно в течение 20 дней в дозе, максимально эквивалентной разовой дозе для человека в пересчете на единицу массы тела.

Наблюдения за животными проводят в течение всего периода введения и последующих 7 суток с ежедневной регистрацией массы тела животных, а также возможных клинических симптомов интоксикации. При исследовании периферической крови опытных животных после введения бактериофага не должны обнаруживаться значительные изменения в содержании лейкоцитов по сравнению с контрольной группой. Необходимо проведение гистологических исследований внутренних органов животных (не менее чем 5 особей) сразу после курса фаготерапии и после 7-дневного восстановительного периода

Определение местного действия бактериофага осуществляется в случае использования препаратов внутримышечно в дозе, предлагаемой для применения. Оценку проводят на основании данных осмотра на протяжении всего срока введения препарата и последующих 7 суток.

Оценка аллергизирующих свойств.

Большинство бактериофагов при первичном применении являются нео-антигенами для организма животных и человека, т.е. заранее имеющихся против них антител в организме нет. Экспериментально показано, что при однократном приеме фильтрата фаголизата иммунный ответ на присутствие фагов в организме незначителен и не влияет на терапевтический эффект фага. Отечественными исследователями доказано, что введение очищенных фаговых препаратов в терапевтических дозах в течение 15 – 20 дней не стимулирует образования антифаговых антител. Вместе с тем имеются данные, что при более длительном применении фага стимуляция адаптивной иммунной системы потенциально вероятна.

Изучение аллергизирующих свойств новых препаратов бактериофагов проводится в соответствии с традиционными методами исследования препаратов МИБП по определению ГНТ и ГЗТ.

Фармакокинетика фаговых препаратов.

Бактериофаги не подвергаются какому-либо специфическому метаболизму в макроорганизме. Результаты изучения особенностей циркуляции фаговых частиц при моделировании инфекционного процесса могут использоваться в качестве дополнительных данных по исследованию нового препарата.

3. Клинические исследования лечебно-профилактических бактериофагов

Поскольку фаговые препараты обладают строгой специфичностью действия, клинические испытания должны предусматривать только этиотропную антибактериальную терапию или профилактирование развития инфекций, обусловленных видами бактерий, соответствующими изучаемому препарату. В этой связи клиническим наблюдениям обязательно предшествует работа по выявлению и сбору бактериальных возбудителей и определению их чувствительности к изучаемому фаговому препарату. На основании полученных результатов может быть расширен диапазон действия препарата за счет его адаптации к устойчивым штаммам.

При организации клинических испытаний необходимо учитывать фагочувствительность штаммов, являющихся возбудителями инфекции, подлежащей лечению. При этом должна быть обеспечена полноценная материальная база для микробиологических исследований.

В настоящее время наибольшую социальную значимость приобрели гнойно-септические заболевания, связанные с пребыванием в стационарах. Все больше видов условно-патогенных бактерий становятся патогенными для ослабленных больных в госпитальных условиях. Для этих штаммов характерны множественная устойчивость к антибиотикам и нарастание вирулентности. Поэтому выбор клинической базы должен основываться на анализе этиологической структуры бактериальных инфекций. Эпидемиологически значимые штаммы, изолированные от больных, полученные из смывов с медицинского оборудования или с объектов больничной среды, подлежат изучению на чувствительность к исследуемому фаговому препарату. Оптимальной моделью для клинических испытаний лечебно-профилактических бактериофагов являются госпитальные инфекции. Изучаемый препарат бактериофагов должен лизировать возбудителей целевых инфекций.

Целью клинических исследований новых лечебно-профилактических препаратов бактериофагов является изучение их эффективности при различных нозологических формах бактериальных инфекций, а также их безопасность и переносимость пациентами с инфекцией различной локализации и степени тяжести. В этой связи подлежат решению следующие задачи:

определение клинической эффективности фагового препарата;

определение микробиологической эффективности фагового препарата;

определение безопасности и переносимости фагового препарата пациентами с различными проявлениями инфекции соответствующей этиологии при различной локализации и степени тяжести;

отработка наиболее оптимальных доз, рациональных схем и длительности применения нового фагового препарата при различных нозоформах и степени тяжести изучаемой инфекции;

сопоставление клинической и микробиологической эффективности и переносимости фагового препарата с антимикробными препаратами, применяемыми при терапии различных нозологических форм данной инфекции.

4. Отработка показаний к назначению исследуемого препарата и рекомендаций по его использованию в медицинской практике

В качестве групп сравнения должны вестись наблюдения за больными с аналогичными заболеваниями соответствующей этиологии, нозоформами и степенью тяжести, получающими традиционную антимикробную терапию.

Дизайн исследования (методология).

Основанием для начала проведения клинических исследований являются результаты отчета по доклиническому изучению нового фагового препарата, проведенному in vitro и на животных.

При планировании и составлении протокола клинических исследований необходимы четкое описание методов выделения и идентификации возбудителей инфекции, оценка клинической значимости выделенных микроорганизмов, их количественная оценка с критериями интерпретации по результатам терапии, описание методов определения чувствительности бактерий к бактериофагам.

При планировании клинических исследований нового фагового препарата необходимо предусмотреть следующее:

основные (первичные) и второстепенные (вторичные) критерии клинической эффективности при каждой нозологической форме наблюдаемой инфекции;

вид исследования (проспективное, двойное слепое, рандомизированное исследование в параллельных группах);

рандомизация пациентов с указанием параметров, например, по степени тяжести, длительности заболевания, предшествующей антимикробной терапии;

дозировка и режим введения, продолжительность курса;

возможность сочетанного применения с базисной антибиотикотерапией, в первую очередь при выявлении нескольких видов бактериальных возбудителей (микст-инфекция);

условия отмены исследуемого препарата или прерывания клинических исследований.

Критерии включения пациентов в клинические исследования.

Лечебно-профилактические бактериофаги являются антибактериальными препаратами узкоспецифической направленности, подавляющими только целевых (гомологичных) возбудителей. Обязательным условием проведения испытаний является фагочувствительность бактериальных штаммов, вызвавших развитие инфекции.

Поскольку антибактериальное действие бактериофагов в отличие от антибиотиков развивается постепенно, для испытания фаговых препаратов в виде монотерапии целесообразно включение больных с нетяжелыми проявлениями изучаемой инфекции. При определенных условиях (по клиническим показаниям) у части наблюдаемых возможно совместное назначение бактериофагов и антибиотиков (в качестве базисной антибиотикотерапии). При этом аналогичная базисная антибиотикотерапия должна проводиться в группе сравнения.

В клинические исследования включаются больные:

у которых выявленный возбудитель чувствителен к изучаемому препарату;

не получавшие антимикробные препараты по поводу данного заболевания или сопутствующих заболеваний;

начавшие получать антимикробную терапию (не более 1 дозы) до включения в исследование, а также через 2 – 3 дня после включения (кроме антибиотиков с коротким курсом – менее 3 суток).

Критериями невключения для клинических исследований новых фаговых препаратов являются анамнестические данные о серьезных неблагоприятных лекарственных реакциях, в том числе о каких-либо аллергических проявлениях, а также о тяжелых сопутствующих соматических заболеваниях. Беременность и лактация не являются противопоказаниями, поскольку бактериофаги являются вирусами бактерий и не обладают тропизмом к клеткам других организмов. Накопленный в течение длительного периода успешный опыт использования лечебно-профилактических бактериофагов при лечении гнойно-воспалительных заболеваний у беременных и кормящих (лактирующих) женщин свидетельствует о безвредности этих препаратов для данной категории пациентов.

Первую фазу клинических исследований проводят для определения реактогенности и безопасности нового лечебно-профилактического фагового препарата для человека, как правило, на здоровых добровольцах, однако может быть получено разрешение на ограниченные исследования у пациентов с нетяжелыми проявлениями инфекции, вызванной бактериальным возбудителем, гомологичным фаговому препарату.

В ходе клинических испытаний первой фазы должны контролироваться клинические и лабораторные данные для выявления нежелательных реакций. В число обследований, как правило, должны входить развернутый клинический анализ крови и клинический анализ мочи. Кроме того, необходима микробиологическая диагностика инфекционного заболевания с количественной характеристикой и определением фагочувствительности возбудителя, предваряющая назначение препарата. Включение пациента в группу наблюдения возможно лишь при выявлении чувствительности бактериального штамма к изучаемому препарату.

После завершения клинических испытаний первой фазы и подтверждения безопасности нового фагового препарата следует продолжение клинических испытаний второй фазы.

Вторую фазу клинических испытаний проводят в виде контролируемых наблюдений за больными с нетяжелыми проявлениями инфекции, вызванной бактериальным возбудителем, чувствительным к изучаемому фаговому препарату. При формировании групп следует учитывать, что у пациентов не должно быть серьезных сопутствующих заболеваний. Изучение эффективности препарата проводят в сопоставлении со стандартными антибактериальными препаратами для лечения данной инфекции. В качестве препаратов сравнения используют антибиотики.

В ходе проведения клинических испытаний второй фазы отрабатываются дозировка и продолжительность курса в зависимости от формы или степени тяжести заболевания. При этом должны контролироваться клинические и лабораторные данные, в том числе развернутый клинический анализ крови и клинический анализ мочи. Кроме того, необходима микробиологическая диагностика инфекционного заболевания с количественной характеристикой и определением чувствительности возбудителя к исследуемому фаговому препарату и антибиотикам. Эти исследования проводят перед началом и по окончании наблюдения.

Проводится анализ состояния пациентов в течение 3 – 4 недель после завершения курса фаготерапии и базисной антимикробной терапии в основной и контрольной группах для определения окончательного (отдаленного) клинического и микробиологического исхода лечения и выявления отдаленных нежелательных реакций. Следует обратить особое внимание на возможность формирования устойчивости возбудителей к антимикробным препаратам (в первую очередь к антибиотикам).

После успешно прошедших клинических испытаний второй фазы проводится третья фаза клинических испытаний в виде расширенных контролируемых наблюдений, главной целью которых служит оценка эффективности и безопасности нового фагового препарата в условиях, максимально приближенных к клинической практике.

Наблюдению подлежат большие группы пациентов (от нескольких сот человек). В протоколе необходимо указать, какие действия следует предпринять в случае неэффективности фаготерапии (определенные диагностические исследования, коррекцию антибактериальной терапии или раскрытие кода рандомизации, если это необходимо в сложившейся клинической ситуации).

Четвертую фазу клинических испытаний проводят после регистрации препарата. По своей организации они подобны клиническим исследованиям третьей фазы и проводятся для оценки клинической эффективности препарата или изучения отдельных аспектов (например, фармакоэкономические преимущества определенных аспектов фаготерапии) на большой и разнородной популяции пациентов.

Все клинические исследования, в том числе третьей и четвертой фазы, предполагают наблюдения за больными с различными проявлениями инфекции, вызванной бактериальным возбудителем, чувствительным к изучаемому фаговому препарату.

Критерии определения эффективности лечебно-профилактических бактериофагов

При клинических испытаниях оценивается как лечебная, так и микробиологическая эффективность препарата, поэтому в протоколе необходимо подробно изложить принципы оценки результатов.

Лечебная эффективность предполагает 3 категории:

эффективность – полное исчезновение всех субъективных и объективных клинических признаков заболевания, уменьшение клинических проявлений или отсутствие прогрессирования по данным объективных исследований;

неэффективность – ухудшение состояния, нарастание всех субъективных и объективных клинических признаков заболевания, появление новых симптомов, летальный исход;

эффективность невозможно оценить – выход пациентов из исследования по каким-либо причинам, в том числе летальный исход во время проведения исследований, не связанный с данным заболеванием.

Обязательно используются показатели лабораторных исследований.

Определение микробиологической эффективности.

Микробиологическая эффективность оценивается после завершения курса фаготерапии и через 3 – 4 недели после проведения курса лечения при последующем наблюдении за пациентом. Возможны следующие оценки результатов терапии:

элиминация возбудителя – прекращение высева (выявления) возбудителя из очага первичной локализации инфекции;

снижение уровня присутствия возбудителя в биологическом материале из очага первичной локализации инфекции. Значительное снижение – на 2 – 3 порядка и более – свидетельствует о наличии микробиологической эффективности;

смена возбудителя или суперинфекция;

колонизация – обнаружение новых микроорганизмов, отличающихся от первоначального возбудителя, в местах первичной локализации инфекции или в других биотопах при отсутствии признаков активного инфекционного процесса.

При наличии микст-инфекции, вызванной двумя или несколькими бактериальными агентами, микробиологическая эффективность оценивается по каждому виду бактериального агента отдельно.

По остальным позициям (оценка безопасности, нежелательные реакции, методы анализа и представления данных) анализ материала проводится согласно требованиям правил надлежащей клинической практики Союза.