ФС.3.3.1.0041.15 Сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Сыворотка противогангренозная                ФС.3.3.1.0041.15

поливалентная лошадиная                                     Взамен ГФ Х, ст.610,

                                                                            ФС 42-3616-98

Настоящая фармакопейная статья распространяется на сыворотку противогангренозную поливалентную лошадиную, представляющую собой иммуноглобулиновую фракцию сыворотки крови лошадей, содержащую специфические антитела, нейтрализующие токсины возбудителей газовой гангрены рода Clostridium (C. perfringens типа A, C. novyi и C. septicum).

Cыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная предназначена для экстренной профилактики и лечения газовой гангрены.

ПРОИЗВОДСТВО

Производство сыворотки противогангренозной поливалентной лошадиной должно быть валидировано с целью подтверждения установленных требований, гарантирующих ее качество и безопасность применения.

Сыворотку получают из плазмы лошадей, гипериммунизированных гангренозными токсинами/анатоксинами. Для получения очищенной концентрированной иммуноглобулиновой фракции плазмы лошади, содержащей антитела (антитоксины), нейтрализующие гангренозные экзотоксины, применяют методы солевого фракционирования, ферментолиза и мембранной фильтрации.

ИСПЫТАНИЯ

Описание

Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость с желтоватым оттенком, без осадка. Определение проводят визуально.

Подлинность

Должна нейтрализовать действие токсинов, продуцируемых C. perfringens типа A, C. novyi и C. septicum. Определение проводят, как описано в разделе «Специфическая активность».

Прозрачность

Показатель оптической плотности не должен превышать 0,05. Определение проводят фотометрическим методом при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 3 мм против контрольного раствора – воды очищенной, если нет других указаний в нормативной документации. 

Цветность

Показатель оптической плотности не должен превышать 0,15. Определение проводят фотометрическим методом при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 3 мм против контрольного раствора – воды очищенной, если нет других указаний в нормативной документации.

Механические включения

Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».

рН

От 6,8 до 7,2, если не указано иначе в нормативной документации. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Белок

От 8 до 14 %, если не указано иначе в нормативной документации. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Определение белка».

Стерильность

Должна быть стерильной. Испытания проводят методами прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС «Стерильность».

Пирогенность

Должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность», если не указано иначе в нормативной документации производителя. Указывают допустимые пределы изменения температуры тела животных и тест-дозу. Если не указано иначе, вводят внутривенно 1 мл неразведенной сыворотки на 1 кг массы кролика.

Аномальная токсичность

Должна быть нетоксичной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность».

Специфическая активность

Не менее 700 международных единиц (МЕ) каждого типа гангренозных антитоксинов в 1 мл. Специфическую активность сыворотки по каждому типу гангренозных антитоксинов определяют в тесте нейтрализации соответствующих токсинов.

Определение опытных доз гангренозных токсинов. Опытная доза токсина (L+/) представляет собой наименьшее количество токсина, которое в смеси с определенным количеством соответствующего антитоксина при внутривенном введении белым мышам вызывает гибель не менее 50 % животных.

Опытную дозу токсина C. perfringens (L+_/10) определяют по отношению к 0,1 МЕ антитоксина С. perfringens, токсина C. septicum (L+_/5) – по отношению к 0,2 МЕ антитоксина С. septicum, токсина C. novyi (L+_/50) – по отношению к 0,02 МЕ антитоксина C. novyi.

Для определения опытных доз для каждого из гангренозных токсинов готовят не менее 4 последовательных разведений, отличающихся между собой по содержанию токсина на 10 – 20 %. К 0,1 МЕ референс-препарата (или стандартного образца активности) антитоксина С. perfringens, или 0,2 МЕ референс-препарата (или стандартного образца активности) антитоксина С. septicum, или 0,02 МЕ референс-препарата (или стандартного образца активности) антитоксина C. novyi, взятых в объеме 0,2 мл, добавляют подготовленные разведения токсинов в объеме 0,3 мл. Смеси готовят из расчета на 5 мышей (1 мл стандартного образца активности антитоксина и 1,5 мл токсина).

Полученные смеси перемешивают и выдерживают при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин, затем каждую вводят по 0,5 мл внутривенно 4 белым мышам.

При определении опытной дозы токсинов C. perfringens и C. septicum наблюдают за животными в течение 48 ч, а при определении опытной дозы токсина C. novyi – в течение 96 ч, отмечая количество выживших мышей в каждой группе.

Определение специфической активности (титра) сыворотки противогангренозной С. perfringens. Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9 % растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, 0,1 МЕ содержалось в 0,2 мл раствора. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина C. perfringens, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6 – 8 разведениями сыворотки (например, 1:1300; 1:1400; 1:1500 и т.д.), отличающимися по своей предполагаемой активности одно от другого на 10 – 20 %.

Каждый опыт титрования (приготовления разведений испытуемой сыворотки) сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,1 МЕ стандартного образца активности антитоксина С. perfringens. После выдерживания при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин смесь из каждой пробирки вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 48 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50 % взятых в опыт мышей. Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 100 % мышей в данной группе, содержит 0,1 МЕ в 0,2 мл, т.е. 0,5 МЕ в 1 мл.

Титр антитоксина С. perfringens в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если максимальное разведение сыворотки, защищающее от гибели 100 %  мышей, соответствует 1:1300, то 1 мл этого разведения содержит 0,5 МЕ антитоксина С. perfringens, следовательно, 1 мл испытуемой сыворотки содержит 0,5 МЕ  1300 = 650 МЕ антитоксина С. perfringens.

Определение титра антитоксина С. septicum. Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9 % растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, в 0,2 мл разведенной сыворотки содержалось 0,2 МЕ. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина C. septicum, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6 – 8 разведениями сыворотки (например, 1:650; 1:700; 1:750 и т.д.), отличающимися по своей предполагаемой активности одно от другого на 10 – 20 %.

Каждый опыт титрования испытуемой сыворотки сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,2 МЕ стандартного образца активности антитоксина С. septicum. После выдерживания при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин смесь токсина с каждым разведением сыворотки вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 48 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50 % взятых в опыт мышей. Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 100 % мышей в группе, содержит 0,2 МЕ в 0,2 мл, т.е. 1 МЕ в 1 мл. Титр антитоксина С. septicum в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если максимальное разведение сыворотки, защищающее от гибели 100 % мышей, соответствует 1:700, то 1 мл этого разведения содержит 1 МЕ, следовательно, 1 мл неразведенной сыворотки содержит 1 МЕ  700 = 700 МЕ антитоксина С. septicum.

Определение титра антитоксина С. novyi. Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9 % растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, 0,02 МЕ содержались в 0,2 мл раствора. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6 – 8 разведениями сыворотки (например, 1:6500; 1:7000; 1:7500 и т.д.), отличающимися по предполагаемой активности одно от другого на 10 – 20 %. Каждый опыт титрования сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,02 МЕ стандартного образца активности антитоксина С. novyi. После инкубирования при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин каждую смесь вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 96 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50 % взятых в опыт мышей.

Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 100 % взятых в опыт белых мышей, содержит 0,02 МЕ в 0,2 мл, т.е. 0,1 МЕ в 1 мл. Титр антитоксина С. novyi в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если максимальное разведение сыворотки, защищающее от гибели 100 % мышей, соответствует 1:8000, то в 1 мл этого разведения содержится 0,1 МЕ антитоксина С. novyi. Следовательно, 1 мл неразведенной сыворотки содержит 0,1 МЕ 8000 = 800 МЕ антитоксина С. novyi.

Активность каждого компонента поливалентной сыворотки рассчитывают, исходя из разведения с наименьшей концентрацией сыворотки, которое в смеси с опытной дозой токсина обеспечивает 100 % выживаемость взятых в опыт животных.

Специфическую активность (титр) поливалентной сыворотки выражают по компоненту с наименьшей активностью. В данном примере – по антитоксину С. perfringens.

Удельная активность

Не менее 500 МЕ на 0,1 г белка каждого типа антитоксина C. perfringens, С. novyi, C. septicum.

Удельную активность (Х) рассчитывают по формуле:

где

Т – титр сыворотки, МЕ/мл;

С – концентрация белка, г/мл;

10 – постоянный коэффициент

Сульфат-ионы

Не более 0,025 %. Определение проводят колориметрическим методом. К 5 мл испытуемого образца и 5 мл рабочего эталонного раствора прибавляют по 0,5 мл 5 % раствора бария хлорида и перемешивают. Через 15 мин пробы перемешивают и измеряют оптическую плотность суспензий при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора, содержащего 5 мл образца и 0,5 мл воды очищенной, для эталонного раствора – вода очищенная (5 мл).

Испытание проводят в 2 повторностях. Для расчета используется среднее значение.

Расчет содержания сульфат-ионов (X) в процентах производят по формуле:

 

где

Аопыт – значение оптической плотности испытуемого образца;

Аэталон – значение оптической плотности рабочего эталонного раствора.

Примечания.

1. Приготовление основного раствора калия сульфата (1 мг/мл сульфат-ионов). В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяю 1,8140 г калия сульфата, высушенного до постоянной массы при температуре 100 – 105 °C, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 1 года.
2. Приготовление рабочего эталонного раствора калия сульфата (0,002 % сульфат-ионов). В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл основного раствора калия сульфата, доводят водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Натрия хлорид

От 0,85 до 0,95 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Количественное определение хлоридов методом обратного осадительного титрования в иммунобиологических лекарственных препаратах».

Хлороформ

Не более 0,1 %. Определение проводят колориметрическим методом, основанным на способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, которое дает цветную реакцию.

В пробирки вносят по 0,1 мл испытуемого образца и образца сравнения (0,1 % раствор хлороформа), добавляют 0,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, 2 мл 20 % раствора натрия гидроксида, 1 мл 10 % раствора резорцина и перемешивают. Содержимое пробирок перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 мин. Пробы осторожно охлаждают до температуры 15 – 18 ⁰С, затем измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, состоящим из 1 мл воды очищенной, 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и 2 мл 20 %  раствора натрия гидроксида. Раствор резорцина в контрольный раствор не добавляют, т.к. продукты его окисления окрашиваются в зеленый цвет.

Расчет содержания хлороформа проводят путем сравнения оптической плотности испытуемого образца и образца сравнения (0,1 % раствор хлороформа).

Содержание хлороформа (Х) в процентах в испытуемом образце вычисляют по формуле:

где

А_исп – значение оптической плотности испытуемого образца;

А_ст – значение оптической плотности образца сравнения – 0,1 % раствора хлороформа.

Примечания.

1. Приготовление 0,1 % раствора хлороформа. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,1 мл хлороформа, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор используют через 24 часа.
2. Приготовление 10 % раствора резорцина. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5 г резорцина, растворяют в 30 мл воды очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Извлекаемый объем

Не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объём лекарственных форм для парентерального применения».

Упаковка и маркировка

В соответствии сОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».

Транспортирование и хранение

При температуре от 2 до 8 ºС, если не указано иначе в нормативной документации. Замораживание не допускается.

Скачать в PDF ФС.3.3.1.0041.15 Сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная