ОФС.1.7.2.0005.15 Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения иммуногенности коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандартному образцу. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella рertussis 18323 по методу Kendrick.

Материалы

Животные

Здоровые мыши с массой тела (11±1) г чувствительной линии или аутбредные мыши, способные давать адекватный иммунный ответ. Используют мышей одного пола или самцов и самок, равномерно распределенных по группам. В 1 опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г. Перед проведением испытания за животными проводят наблюдение в течение 3 сут. При гибели более 10 % мышей данную партию не используют.

Референс-препараты

• стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины, калиброванный в МЕ по соответствующему международному стандартному образцу;
• стандартный образец мутности 10 МЕ, калиброванный в международных оптических единицах (МЕ).

Тест-штамм

B. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно.

Среды

Используют среды Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА), их модификации или другие среды, адаптированные к коклюшному микробу.

Среда Борде-Жангу

В 1500 мл воды очищенной последовательно растворяют ингредиенты:

• калий фосфорнокислый двузамещенный – 2,25 г,
• калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,75 г,
• калий хлористый – 1,5 г,
• магний сернокислый – 0,075 г,
• натрий хлористый – 7,5 г.

Полученный солевой раствор до внесения следующих ингредиентов должен иметь рН 7,4–7,5.

Затем в солевой раствор вносят:

• фильтрат картофельного отвара – 500 мл,
• агар зарубежных фирм «Дифко» (США) или «Мерк» (Германия) – 60 г.

Среду кипятят до полного растворения агара, устанавливают рН 7,1–7,2, разливают по (200 ± 5) мл в стерильные флаконы вместимостью 500 мл и стерилизуют при температуре 110 ºС в течение 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 3 мес.

Фильтрат картофельного отвара

В 1 л воды очищенной вносят 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и кипятят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля втечение 1,0–1,5 ч. Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку. Картофельный отвар используют свежеприготовленным.

Для получения  среды Борде-Жангу с 30 % крови содержимое флакона нагревают до температуры 50-55 ºС, вносят 60 мл дефибринированной крови человека, перемешивают и разливают в чашки Петри. Срок хранения среды с кровью – 10 сут при температуре от 2 до 8 ºС.

Примечание.

Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие возбудителей инфекций, которые передаются при гемотрансфузиях, в соответствии с утвержденными уполномоченными органами РФ «Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови» и «Инструкцией по проведению донорского прерывистого плазмафереза». Срок хранения крови не более 2 сут.

Среда КУА (казеиново-угольный агар)

На 1 л среды добавляют:

• гидролизат казеина – (170 ± 5) мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержание аминного азота составляло от 150 до160 мг%),
• дрожжевой диализат – (90 ± 10) мл,
• калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,5 г,
• магний хлористый 6-водный – 0,4 г,
• крахмал растворимый – 1,5 г,
• кальций хлористый – 0,01 г или 1 % раствор – 1 мл,
• железо сернокислое 7-водное – 0,01 г или 0,5 % раствор – 2 мл,
• медь сернокислая 5-водная – 0,005 г или 0,2 % раствор – 2 мл,
• цистеин -0,03 г или 1,5 % раствор – 2 мл,
• агар микробиологический – 30,0 г,
• уголь активированный – 2 г.

Содержание хлоридов в среде должно составлять (0,75 ± 0,15) %, аминного азота (155 ± 10 мг %); рН среды доводят до 7,0-7,1 с помощью 20 % раствора натрия гидроксида.

Среду разливают в матрацы по (250 ± 10) мл, пробирки по (11 ± 1) мл и флаконы вместимостью 500 мл по (200 ± 5) мл, стерилизуют 30 мин при температуре 110 ºС и хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 мес. Для получения среды с 10 % крови содержимое флакона растапливают,  охлаждают до температуры 50–55 ºС, вносят 20 мл дефибринированной крови человека и перемешивают. Срок хранения среды с кровью 10 сут при температуре от 2 до 8 ºС.

Гидролизат казеина:

• казеин (сухой) – 2000 г,
• хлористоводородная кислота концентрированная – 1000 мл,
• вода очищенная – 500 мл.

Степень расщепления белка – не менее 93 %. Аминный азот  850-1000 мг %, общий азот 910-1080 мг %, натрия хлорид 4-6 %. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 110 ºС. Среду используют свежеприготовленной (при добавлении 0,5 % хлороформа срок хранения 1 год при температуре от 2 до 8 ºС).

Дрожжевой диализат:

• дрожжи хлебопекарные – 1000 г,
• вода очищенная – 1000 мл,
• хлороформ – 4 мл.

Аминный азот – не менее 0,54 мг/мл. Срок хранения 3 мес при температуре от 2 до 8 ºС.

1 % раствор гидролизата казеина

Гидролизат казеина – 10 мл (аминный азот 8,5–10,0 мг/мл), натрий хлористый – 6,0 г (до концентрации хлоридов 0,6 %), вода очищенная – до 1000 мл. С помощью 20 % раствора натрия гидроксида рН доводят до (7,1±0,2). Среду стерилизуют 15 мин при температуре 121 ºС. Срок хранения 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 сут.

Метод исследования иммуногенной активности коклюшной вакцины

Мышей распределяют в группы по 18-20 животных в каждой: по 2 группы для испытуемого и референс-препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма B. pertussis 18323 (определение LD₅₀ культуры)  из этой же партии животных формируют 4 группы по 10 мышей в каждой.

Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках, и порядок введения разрешающей дозы.

Иммунизация мышей

Готовят по 3 пятикратных разведения испытуемого и референс-препаратов. В качестве растворителя используют 0,9 % раствор натрия хлорида, рН (7,1 ± 0,2). В интервале используемых разведений каждого образца должна содержаться средняя эффективная доза ЕD₅₀.

В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 МЕ (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).

Таблица 1– Пример разведения референс-препарата

Разведение	Объем вносимого разведения I референс-препарата, мл	Объем вносимого растворителя, мл	Разведения референс-препарата (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза– 0,5 мл
				Количество исходного референс-препарата, мл	Количество МЕ
I	15	0	1:60	0,0167	0,5
II	2,5	10,0	1:300	0,0033	0,1
III	0,5	12,0	1:1500	0,00066	0,02

Образец испытуемой вакцины разводят в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если полученное в опыте значение ЕD₅₀ испытуемой вакцины будет больше значений использованных доз, необходимо изменить разведение I (например, 1:10). Последующие 2 разведения делают по вышеприведенной схеме.

Приготовленные разведения вакцины и референс-препарата хранят при температуре от 2 до 8 ºС и используют в течение не более 4 ч.

Таблица 2 – Пример разведения испытуемой вакцины

Разведение	Объем вно-симого I разведения вакцины, мл	Объем вносимого растворителя, мл	Кратность разведений исходной вакцины (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза в объеме 0,5 мл
				Количество исходной вакцины, мл	Количество МЕ (предполагаемое содержание)
I	14	0	1:28	0,0357	0,5
II	2,5	10,0	1:140	0,0071	0,1
III	0,5	12,0	1:700	0,00142	0,02

Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл одного из разведений испытуемой вакцины или референс-препарата. К моменту введения заражающей дозы не менее 94 % иммунизированных мышей должно остаться в живых и без признаков заболевания. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.

Приготовление заражающей суспензии тест-штамма B. рertussis 18323

Бактериальную суспензию B. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20-24-часовой культуры второго–третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу, с кровью человека или КУА с кровью человека или на других, адаптированных к коклюшному микробу средах.

Выросшую культуру контролируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Микробные клетки B. рertussis 18323 должны быть морфологически однородны. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать.

Готовят бактериальную суспензию микробных клеток с концентрацией, соответствующей 10 МЕ по стандартному образцу мутности (разведение 1_А). Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% раствор натрия хлорида, рН (7,1±0,2).

Полученную суспензию разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл (100–1000 LD₅₀) . Из рабочей суспензии готовят разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения LD₅₀  тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл. 3).

Таблица 3 – Пример разведения тест-штамма B. рertussis 18323

Номер пробирки	Кратность разведения	Объем перено- симой суспен-зии из предыдущей пробирки в последующую, мл	Объем внесенного растворителя,мл	Полученная суспензия содержит в 0,03 мл (эквивалентно)	Назначение
1	1А : 3	1	2	100 млн
2	1I : 10	0,5	4,5	10 млн
3	12 : 10	0,5	4,5	1 млн
4	13 : 10	2	18	100000	Разливают в 3 пробирки для заражения – рабочая суспензия
5	14 : 10	0,5	4,5	10000	Для определения LD50 штамма
6	15 : 5	1,0	4,0	2000
7	16 : 5	1,0	4,0	400
8	17 : 5	1,0	4,0	80

Из пробирки 8 сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью с целью подсчета количества содержащихся в ней живых клеток, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Культуру помещают в термостат с температурой (36 ± 0,5) ^оС на 3-4 сут. Для определения количества КОЕ в 30 мкл проводят подсчёт выросших колоний на 3 чашках и полученное значение делят на 10. В 0,03 мл разведения из пробирки 8 должно быть не более 50 КОЕ.

При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента приготовления смыва культуры.

Если в испытании используют высокочувствительную к коклюшным антигенам линию мышей, то заражающую дозу тест-штамма 18323 следует уменьшить до содержания 100–1000 LD₅₀  в объеме 0,03 мл.

Заражение иммунизированных животных

Мышам, иммунизированным испытуемой вакциной и референс-препаратом, через 14-17 сут интрацеребрально вводят по 0,03 мл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма B. рertussis 18323 (пробирка 4) путем прокола лобной кости в точке, расположенной в 2 мм от средней линии и на 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу № 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины LD₅₀ разведения заражающей дозы (пробирки 5, 6, 7, 8) вводят контрольным мышам соответствующих групп интрацеребрально по 0,03 мл.

Мышей, погибших в течение 3 сут после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель); в каждой клетке оставляют по 16 мышей.

За зараженными животными наблюдают 14 сут с ежедневной регистрацией их гибели. В день учета результатов (14-е сут) в число погибших включают также всех парализованных мышей.

Вычисление величины LD₅₀  (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:

lgLD₅₀ = lg D_N–δ(∑Li–0,5),

где

D_N – максимальная из испытуемых доз;

δ – логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);

Li – отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

∑Li – сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Таблица 4 – Пример расчета величины LD₅₀ культуры тест-штамма B. рertussis 18323

Доза культуры (число микробных клеток) 0,03 мл	Число зараженных животных	Число погибших (парализованных) из общего числа зараженных животных	Значения Li	LD50	Кол-во колоний в заражаю-щей дозе 80 клеток
104	10	9/10	0,9	648	23
2 103	10	7/10	0,7
4 102	10	4/10	0,4
80	10	2/10	0,2

∑Li=2,2

lg LD₅₀ = lg 10⁴–lg 5 (2,2–0,5)=4,0–0,699 1,7=2,8117

LD₅₀=648 микробных клеток.

В заражающей дозе (10⁵ микробных клеток) содержится 648=154 LD₅₀

Оценка иммуногенной активности испытуемой вакцины

Расчет иммуногенной активности испытуемого препарата проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США (для n=16) или статистическим методом с помощью программы Probit-analysis. Для проведения расчета в таблице Вильсона-Вустера (табл. 5) по вертикальной оси отмечают величину, равную сумме выживших мышей от всех 3 доз препарата (А), по горизонтальной оси – разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыт (В). В месте пересечения прямых, проведённых от соответствующих величин А и В, находят ЕD₅₀ (верхняя цифра) и её стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Найденное значение соответствует ЕD₅₀ для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины ЕD₅₀  в опыте, найденную в таблице величину ЕD₅₀ делят на 100 и умножают на значение средней иммунизирующей дозы в данном опыте. Результаты опыта считают достоверными, если стандартное отклонение средней иммунизирующей дозы  не ниже 64 % и не выше 157 % от найденного значения ЕD₅₀.

Примеры расчета количества МЕ в 1 мл по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6.

Таблица 5 –  Таблица Вильсона-Вустера

Таблица 6 – Пример расчета иммуногенной активности вакцины

Препарат	Доза препарата в 0,5 мл			Количество выживших мышей/общее число зараженных в группе	Величины А/В и ЕD50 по таблице	ЕD50 (стандарт-ные от-клонения в опыте)
	Разведение	Количество исходного препарата,мл	Количе-ство МЕ в имму-низирующей дозе
Референс-препарат	1:60	0,0167	0,5	14/16	27/11 71,3 72–139	0,0023 (0,00327– 0,00169)
	1:300	0,0033	0,1	10/16
	1:1500	0,00066	0,02	3/16
Вакцина	1:28	0,0357		13/16	23/11 111,75 72–139	0,0079 (0,011– -0,0057)
	1:140	0,0071		8/16
	1:700	0,00142		2/16

Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 МЕ (табл. 6). При определении ЕD₅₀  референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в МЕ.

Количество МЕ в 1 мл вакцины определяют по формуле:

Доверительный интервал значения иммуногенности (МЕ/мл) препарата рассчитывают по формулам:

где

R – количество МЕ в 1 мл препарата;

R_мин – нижний предел доверительного интервала;

R_макс  – верхний предел доверительного интервала;

К – доверительный коэффициент.

где S₁ = (lg ЕD₅₀ )_макс.-lg ЕD ₅₀  для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия – 95  или 99%;

S₂ = lg ЕD₅₀-(lg ЕD₅₀)_мин. для менее иммуногенного препарата.

Для примера:

К=1,6

Отсюда:

Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 МЕ с доверительным интервалом от 5,6 до 14,4 МЕ.

Если в первом опыте активность препарата не соответствует установленным требованиям, опыт повторяют. В этом случае при вычислении количества МЕ в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3). Используют расчет средней геометрической (Xгеом.) величины значения по формуле:

где

П_x – произведение усредняемых величин;

n – число определений.

Критерии достоверности теста:

• ЕD₅₀ референс-препарата и испытуемой вакцины лежит в интервале между наибольшей и наименьшей иммунизирующими дозами;
• LD₅₀  не превышает 1000 микробных клеток;
• заражающая доза микробных клеток содержит не менее 100 и не более 1000 LD₅₀;
• в 0,03 мл разведения из пробирки 8 содержится не более 50 КОЕ.

Скачать в PDF ОФС.1.7.2.0005.15 Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин